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植物总RNA的提取与电泳
1. 试验目的和规定
掌握RNA制备以及常用鉴定措施的原理、操作环节、注意事项和技术关键。
2. 有关基础知识
由于RNA是基因体现过程中非常重要的生物分子，如mRNA,它携带了DNA的所有编码信息。RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northern blot、RT-PCR、构建 cDNA文库、Gene Chips以及体外翻译等试验。
由于RNase极稳定，因此，在操作RNA时，要格外仔细，以防RNA被降解。在提取RNA之前，必须对所用器皿进行RNase灭活处理。如用180oC干烤8小时以上处理玻璃器皿，的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其他用品。 DEPC水处理，但Tris-Cl缓冲液等不可以用DEPC处理。
注意：DEPC有致癌之嫌 ，必须小心操作，防止接触与吸入 ！
植物细胞内的RNA重要是 rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和 mRNA（占1～5％）。rRNA含量最丰富，由25S、18S和5S几类构成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在3’端均有一种polyA尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(OligodT)层析柱从总RNA中将 mRNA分离出来。一般状况下，提取的总RNA也可用于Northern blot试验。
提取植物RNA时，要注意的问题：
1）一般用机械研磨的措施破碎植物
组织细胞；
2）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白
与RNA分离并释放出RNA；
3）克制内源和外源RNase活性；
4）将RNA与DNA、蛋白质及其他细
胞成分分开。
苯酚法：用SDS变性蛋白并克制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；
胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和-巯基乙醇变性蛋白，并克制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀；
氯化锂沉淀法：由于锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，并且残留的锂离子对mRNA有克制作用。
已经有多种较为成熟的分离总RNA的措施，常用的有3种:
本试验采用QIAGEN试剂盒，其原理是根据胍盐法。即在具有强的异硫氰酸胍变性剂的提取液中裂解植物组织粉末，在提取缓冲液中具有RNase克制剂，克制RNase活性，保证RNA的完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留在柱子上，溶液均质化，包括RNA在内的分子物质通过离心柱。加入乙醇后，再过第二个离心柱，RN A就结合在柱子底部有硅胶的膜上，洗去其他杂质，最终用无RNase的水溶出RNA。该柱子可结合100g不小于200bp的RNA，因此应控制起始材料的用量。
RNA的检测：
RNA的检测重要用琼脂糖凝胶电泳，分为非变性电泳和变性电泳。一般变性电泳用的最多是甲醛变性电泳（如Northern blot 试验过程中）。