基础学习实验目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定.pptx

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及其扩增产物判定分析
综合性设计性试验-8
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此试验共包含以下六个部分
第一部分，目标基因选择
第二部分，PCR引物设计
第三部分，PCR试验操作
第四部分，PCR产物电泳判定
第五部分，PCR产物测序判定
第六部分，目标基因序列变异分析
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PCR技术创造
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PCR与临床诊疗
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第一部分，目标基因选择
候选基因介绍
在本试验中，有三个候选基因，分别是NGAL，Fascin和Ezrin。
这三个基因在食管癌及其它各种肿瘤中呈过表示，说明它们在肿瘤发生发展中起主要生物学作用。
汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进行了深入研究，在国外杂志上发表SCI收录研究论文20余篇，已形成系列优势。
同学们可查阅相关资料，选择感兴趣基因来做PCR试验。
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NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（lipocalin) 家族一个组员。
NGAL基因蛋白产物含有保护调整基质金属蛋白酶-9活性，作为小分子铁配合物结合蛋白参加机体铁代谢和天然免疫反应等功效。另外，NGAL作为一个早期标志物还能够帮助判定缺血性肾损伤程度。
NGALmRNA信息在NCBI核酸数据库中有来自不一样试验室登记多个版本，包含完整编码区有BC033089和NM_005564等，编码区长为597 bp，编码198个氨基酸，包含了N端前部长为20个氨基酸信号肽序列（为核酸序列1-60 bp）。
NGAL 基因
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NGAL核酸编码区序列及其对应蛋白序列：
前20个AA为信号肽序列
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年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞系SHEE 和食管癌细胞系SHEEC 互为对照，用cDNA 微列阵进行筛选，用RNA 印迹和RT-PCR 进行判定，cDNA 克隆测序后与GenBank 进行BLAST 分析比较。结果表明NGAL 基因在SHEEC中出现显著差异过表示，其cDNA 序列与小鼠24p3、大鼠NRL (neu-related lipocalin) 和人中性粒细胞NGAL 含有较高相同性。这提醒NGAL 基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着主要作用，可能是一个新癌基因或促癌基因。
A
B
利用cDNA 芯片筛选两种细胞差异表示基因


A B C
反转录PCR检测NGAL在两种细胞mRNA水平


C. 100 bp DNA marker
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Fascin蛋白mRNA全长为2767bp，由5‘端非翻译区111bp碱基，3’端非翻译区1174bp碱基，1482bp全编码序列区和6个PloyA信号肽组成，编码493个氨基酸，分子量约为55kD。
Fascin蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶(ruffles)，边缘丝状伪足(filopodia)、微棘(microspikes)关键肌动蛋白束中。
以往研究发觉，Fascin基因在许多上皮起源肿瘤细胞系，如宫颈癌Hela、胃癌AGS、大肠癌LM1215和SW480、胰腺癌BxPC3和T3H4等细胞系中均上调表示。
细胞丝状伪足和微棘与细胞运动，癌细胞转移有亲密关系，提醒Fascin蛋白可能在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。
Fascin 基因
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