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王俊峰;尹尧;陈玉花;加春生;王晓楠
【摘 要】[目的]从抗生素废水处理的活性污泥中筛选出具有高效降解力量的菌 株.[方法]从抗生素制药工业废水处理的活性污泥中分别到 1 株抗生素高效降解菌
NG3,对其进展形态学、生理生化鉴定和 16SrDNA 序列比对分析,同时对该菌株的生物学特性进展初步争论.[结果]从抗生素制药工业废水处理的活性污泥中分别得到1 株抗生素高效降解菌 NG3,经形态学、生理生化鉴定和 16SrDNA 序列比对分析, 确定该菌株属于不动杆菌属(Acinetobacter sp.),命名为 Acinetobacter
.[结论]为抗生素类工业废水高效处理供给借鉴.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2025(000)031
【总页数】3 页(P10851-10852,10900)
【关键词】抗生素;16SrDNA;Acinetobacter;降解菌
【作 者】王俊峰;尹尧;陈玉花;加春生;王晓楠
【作者单位】黑龙江农业工程职业学院,黑龙江哈尔滨 150088;哈药集团生物疫苗,黑龙江哈尔滨 150025;黑龙江农业工程职业学院,黑龙江哈尔滨 150088; 黑龙江农业工程职业学院,黑龙江哈尔滨 150088;黑龙江农业工程职业学院,黑龙江哈尔滨 150088
【正文语种】中 文
【中图分类】S188
近年来，随着抗生素制药工业的快速进展，抗生素工业废水已成为严峻危害人类健 康和生态环境平衡的麻烦问题，对抗生素制药工业废水进展有效处理已经刻不容缓， 成为制约社会可持续进展的紧要问题［ 1］。抗生素生产过程中产生大量的发酵液、酸废水、碱废水和有机溶剂废水等。其具有有机物浓度高、存在生物毒性物质、色 度高、气味重、pH 波动大等特征［2］。目前，抗生素制约工业废水处理方法主
要有化学处理法、物化处理法(包括混凝－沉淀法、反渗透－膜分别法、吸附法、光降解法、包埋法及电解法等)、生物处理法以及多种方法复合处理等。其中生物
处理方法具有处理条件较为温顺、微生物适应性较强、费用低廉、较易培育等优点， 现已广泛应用于抗生素制药工业废水的处理［3］。笔者试图从抗生素废水处理的
活性污泥中筛选出具有高效降解力量的菌株，并争论其生物降解特性，应用于实际生产，以期为抗生素类工业废水高效处理供给借鉴。
材料与方法
水样 试验水样取自哈尔滨某制药企业废水排放口，活性污泥取自曝气池的回流污泥。
培育 基 ①无机盐培育基:KH2PO4 g/L，Na2HPO4·12H2O g/L， MgSO4·7H2O g/L，(NH4)2SO4 g/L，微量元素 1 ml，121℃高压蒸汽灭菌 20 min。②LB 培育基:蛋白胨 g/L，酵母膏 g/L，NaCl g/L， 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min，固体培育基中琼脂含量为 %。
试验方法
高效降解菌株的分别筛选。(1)增殖培育:取 2 ml 活性污泥沉淀的上清液，接种到装液量 200 ml 的三角瓶中，于 30℃、100 r/min 下培育 48 h，而后进展琼脂平板划线分别，分别得到的单菌落经屡次反复分别、纯化后得到纯菌株［4］。(2)菌株筛选:将分别纯化得到的菌落特征较典型、性状较优良的纯菌株分别接种到
含 50%废水的无机盐培育基中，于 30℃、100 r/min 条件下培育 48 h，依据菌
体的生长状况和对 COD 的去除率，筛选出降解率高的优势菌株［5－6］。
菌株的鉴定。(1)形态、培育及生理生化特征鉴定。对纯培育菌株的菌落特征、培育特征和生理生化特征进展观看与鉴定，同时承受透射电镜进展观看［7］。(2)16SrDNA 序列分析法鉴定。以细菌总 DNA 为模板，选取一对细菌通用引物进
行扩增，其核酸序列如下:引物 BSF8/20:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’( rDNA 对应位点为 8～27);引物 BSR1541\20:5’- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’( 的 16s rDNA 对应位点为 1541～
1522)。PCR 反响条件:94℃变性 1min，55℃复性 1 min，72℃延长 2 min，在此条件下进展 30 个循环，然后在 72℃下保温 10 min，测序由大连宝生物工程完成。将菌株 NG3 16s rDNA 核酸序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数据库进展比对分析( ://\blast)，由 Gen-Bank 中得到相关菌株的序列，与该争论所测的序列一起输入 程序进展 DNA 同源性序列分析［8］。
生物量与 COD 测定。生物量用光密度 OD600 表示，COD 的测定用重铬酸钾法［9］。
NG3 菌株的生长及降解特性。承受正交试验法争论高效降解菌 NG3 菌株的生长及降解特性［10］。其正交试验的因素与水平见表 1。
表 1 NG3 菌株正交试验的因素与水平水平 因素温度∥℃ 转速∥r/min pH 1 25
100 2 30 125 3 35 150
结果与分析
形态、培育及局部生理生化鉴定结果 NG3 菌株为革兰氏阴性菌，好氧，菌体呈杆状，无芽胞，无鞭毛(图 1)，菌落呈乳白色，菌落边缘整齐，微凸起，外表及边缘较光滑，黏稠易挑起(图 2)，其生理生化特征见表 2。
图 1 NG3 菌株电镜照片
图 2 NG3 菌株菌落照片
表 2 NG3 菌株的生理生化特征鉴定工程 结果 鉴定工程 结果淀粉水解试验 － 吲哚试验 －明胶水解试验 － 甲基红试验 －酪蛋白水解试验 － V-P 试验 －接触酶试验 + 柠檬酸盐试验+糖发酵试验 － 硫化氢试验 －氧化酶试验 － 硝酸盐试验 －
降解菌 NG3 的 16Sr DNA 基因 PCR 扩增和序列分析
PCR 扩增和测序结果。以 NG3 菌株总 DNA 为模板，用 16SrDNA 的通用引物进展 PCR 扩增，得到 1 条约 kb 的片段(图 3)。扩增片段经回收、测序， 明确该片段大小为 1 475 bp。
NG3 菌株核酸序列同源性比较。将 NG3 菌株 16SrDNA 测序结果输入GenBank 中，利用 Blast 软件进展序列同源性分析，结果说明，NG3 与Acinetobacter(不动杆菌属)的大多数菌种的相像度到达 95%以上，其中 NG3 与菌种 Acinetobacter 的 16SrDNA 序列相像度到达 99%。
图 3 16Sr DNA 引物 PCR 扩增结果注: 标准分子量 marker，。
Acinetobacter 菌株的生长及降解特性 Acinetobacter 菌株正交试验结果见表 3。
表 3 NG3 菌株正交试验结果试验序号 因素时间∥℃ 转数∥COD 去除率 r/min pH %1 2 1 2 2 1 1 1 3 4 2 1 2 1 3 3 5 6 2 3 1
2 2 3 7 8 3 2 1 3 1 3 9 k1 3 2 18 k2
k3 R
由表 3 可知，Acinetobacter 菌株对温度较为敏感，直接影响其抗生素的降解效率，各因素对有机物 COD 去除率的影响挨次为温度＞摇床转速＞ pH;Acinetobacter 菌株最正确降解条件是:温度为 35℃，摇床转速为 150 r/min，初始 pH 为 。
结论
该试验通过选择性富集培育，从高浓度抗生素制药工业废水处理的活性污泥中筛选得到一株具有较高抗生素降解力量的优势降解菌 NG3，经染色观看、形态特征、培育特征及生理生化特征鉴定和 16SrDNA 序列分析，最终确定 NG3 菌株为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。进一步的降解争论说明，Acinetobacter 菌株的降解作用受温度影响较敏感，可能是温度影响 NG3 菌分泌的降解抗生素的代
谢酶的活性，其次是转速，通过摇瓶发酵试验说明，转速大小直接影响氧气的供给， pH 影响最小。最终确定其最正确降解条件为:温度为 35℃，摇床转速为 150 r/min， 初始 pH 为 。Acineto-bacter 菌株是从自然环境中筛选获得的野生型
菌株，经发酵优化后其 COD 去除率到达 %，作为工业化大规模处理抗生素制药废水并不肯定抱负，但可作为动身菌株，通过人工诱变育种的方法筛选 COD 去除率较高的优势菌株;也可以对其进展基因克隆，利用基因工程的方法构建工程菌， 以适合大规模工业化进展抗生素制药废水处理的需要。
参考文献
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