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任静静;杨铭伟;剡根强;蒋建军;王鹏雁
【摘 要】为探究不同环境因子及接种量对单增李斯特菌(LM90)生长特性的影响,本试验通过测定 LM90 在各培育条件下的D 600 nm 值,分析了不同的温度、NaCl 浓度、pH,以及温度(0～40℃,梯度为 10℃)、NaCl 浓度(3％～8％,梯度为 1％)、pH(6～9,梯度为 1)的交互作用下 LM90 ,菌株的对数增长期为
8～16 h,稳定期为 16～20 h,20 h 以后进入衰亡期;菌株在 NaCl 浓度为 ％～4％ 时生长良好,其最适生长 pH 为 ,最适生长温度为 37℃.通过 SPSS 软件进展方差分析可知,各因素的交互作用均对 LM90 有极显著影响(P<).本争论为进一
步探讨温度、NaCl 浓度、pH 等因素对 LM 生长的影响及 LM 抗环境胁迫的作用机制奠定了根底.%In order to explore the growth characteristics of the Listeria monocytogenes (LM90) strain under different environmental factors and inoculum size,the D 600 nm value of bacteria culture broth were measured,the growth status of LM90 under different NaCl concentration,pH value, temperature and the interactions of NaCl concentration (3％ to 8％,1％ for per gradient),pH (6 to 9,one for per gradient),temperature (0 to 40 ℃,10 ℃ for per gradient)had been analyzed. The results showed that the strain was in the logarithmic phase when culturing for 8 to 16 h,then entered the stationary phase when culturing for 16 to 20 h,and finally went to decline phase when culturing after 20 could grow well when the NaCl concentration was ％ to 4％.Its opti- mum growth pH and temperature were and 37 ℃, interaction effect of each two factor had been analyzed by variance
analysis of SPSS software,and it found that the interac-tion effects was
extremely significantly (P <).The study lay a foundation for exploring the effects of environmental factors on LM90 growth and mechanisms of resistance to environmental stresses.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2025(044)005
【总页数】7 页(P1491-1497)
【关键词】单增李斯特菌;温度;NaCl 浓度;pH;环境因子
【作 者】任静静;杨铭伟;剡根强;蒋建军;王鹏雁
【作者单位】石河子大学动物科技学院,石河子 832025;石河子大学动物科技学院, 石河子 832025;石河子大学动物科技学院,石河子 832025;石河子大学动物科技学院,石河子 832025;石河子大学动物科技学院,石河子 832025
【正文语种】中 文
【中图分类】R378
单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称 LM)是一种对人畜危害极为严峻的人畜共患病病原菌，也是目前国际公认的重要食源性病原菌之一，在食品中具有相当高的污染率[1-2]。LM 是一种革兰氏阳性短杆菌，具有流行广泛、危害严峻等特征，广泛存在于自然界中，在海水、地表水、污水、土壤、粪肥、青贮饲料中都能够分别得到 LM[3]。LM 作为一类重要的人畜共患病的条件致病菌， 可引起人类和多种畜禽的疾病，人畜感染 LM 后主要表现为急性脑膜炎、败血症； 家禽感染后主要表现为脑膜炎、坏死性心肌炎及坏死性肝炎[4-5]。LM 生命力顽
强，在 4 ℃以下的低温环境中仍可生长生殖[6]，冷藏食品常常被 LM 污染，且其
对各种应激条件(低温、高盐、pH、氧化应激等)均具有较强的耐受性，这些因素也进一步增大了 LM 的危害性[7]。争论说明，低温可增加 LM 对药物的耐受性[8- 10]。Sigma B 作为 LM 最重要的应激调控因子，其缺失时可导致 LM 在体外酸或盐应激条件下的存活率显著降低[11-12]。本争论同时用 D600 nm 值和菌落总数两种方法测定了 LM 的生长曲线并分析了不同接种量对 LM 生长的影响，同时比照分析了常见环境应激条件(温度、NaCl 浓度、pH)对 LM 生长的影响，初步探讨了NaCl 浓度、pH、温度交互作用下 LM 的生长状况，并用 SPSS 对各种因素的交互作用进展了方差分析，旨在为进一步探讨温度、NaCl 浓度、pH 等因素对LM 生长的影响及其抗环境胁迫的作用机制奠定根底。
材料
菌株 单增李斯特菌 LM90(4b 血清型)为疆致绵羊脑炎分别株，由石河子大学动物科技学院预防兽医学试验室分别、鉴定并保存。
主要试剂与仪器 脑心浸液(BHI)购自 BD 公司。HANNA PH211 台式酸度计购自 Romania 公司；Power Wave XS2 连续波长酶标仪购自 BioTeck 公司。
方法
种子菌液的培育 无菌条件下，取-80 ℃保存的 LM90 菌种在室温下解冻， 划线接种于无菌 BHI 固体平板，37 ℃培育 18～24 h，挑取典型的单个菌落接种于 BHI 中，37 ℃培育至菌液浓度达 108 CFU/mL，扩大培育备用。
LM90 生长曲线的测定 取 1×104 CFU/mL 的菌液 1 mL 接种于含有 9 mL BHI 液体培育基(pH )的试管中，37 ℃恒温静置培育。用酶标仪测定菌液的D600 nm 值，并结合活菌稀释计数法同时涂布 BHI 固体平板测定菌落总数，每隔2 h 重复测定 1 次。分别以培育时间为横坐标，D600 nm、菌落总数为纵坐标， 绘制生长曲线。
不同接种量对 LM90 生长的影响 将高压灭菌后的 BHI 液体培育基无菌移取
到 96 孔板中，200 μL/孔，每组 3 个平行。将菌悬液分别稀释到 1×101、1×103、1×105、1×107 CFU/mL，每孔 50 μL，然后滴加 50 μL 无菌石蜡油并盖上无菌
塑料盖，置于 37 ℃恒温培育箱中培育，每隔 2 h 取出培育板放入酶标仪，读取各孔 D600 nm 值。
温度对 LM90 生长的影响 取 1×104 CFU/mL 的菌液 1 mL 接种到数支装有
9 mL BHI 液体培育基(pH )的试管中，分别于 4、10、15、20、25、30、35、37、42、45 ℃恒温培育箱中静置培育 16 h，每个温度 2 个平行。测定各温度条
件下菌液的 D600 nm 值，以温度为横坐标、D600 nm 值为纵坐标，绘制生长曲线。
NaCl 浓度对 LM90 生长的影响 取 1×104 CFU/mL 的菌液 1 mL 接种到装有 9 mL NaCl 的 BHI 液体培育基(pH )的试管中(NaCl 浓度分别为 %～ %，梯度为 1%)，每个梯度 2 个平行，37 ℃恒温静置培育 16 h，测定各NaCl 浓度下菌液 D600 nm 值，以 NaCl 浓度为横坐标、D600 nm 值为纵坐标， 绘制生长曲线。
pH 对 LM90 生长的影响 取 1×104 CFU/mL 的菌液 1 mL 接种到装有 9 mL 灭菌后 pH 分别为 、、、、、、、、、 的BHI 液体培育基试管中，每个 pH 2 个平行，37 ℃恒温静置培育 16 h，测定各pH 条件下菌液 D600 nm 值，以 pH 为横坐标、D600 nm 值为纵坐标，绘制生长曲线。
温度和 pH 对 LM90 生长的影响 在最适 NaCl 浓度下，选取 pH 6～9(梯度为 1)，温度 0～40 ℃(梯度为 10 ℃)，共计 20 种组合，测定 LM90 接种于上述BHI 液体培育基(初始菌液浓度为 1×104 CFU/mL)培育 16 h 后 D600 nm 值，每种组合 2 个平行。
NaCl 浓度和温度对 LM90 生长的影响 在最适 pH 条件下，选取 NaCl 浓度
3%～8%(梯度为 1%)，温度 0～40 ℃(梯度为 10 ℃)，共计 30 种组合，应用酶标仪测定 LM90 接种于上述 BHI 液体培育基(初始菌液浓度为 1×104 CFU/mL)培育16 h 后的 D600 nm 值，每种组合 2 个平行。
NaCl 浓度和 pH 对 LM90 生长的影响 在最适温度下，选取 pH 6～9(梯度为 1)，NaCl 浓度 3%～8%(梯度为 1%)，共计 24 种组合，应用酶标仪测定 LM90 接种于上述 BHI 液体培育基(初始菌液浓度为 1×104 CFU/mL)培育 16 h 后的D600 nm 值，每种组合 2 个平行。
LM90 的生长曲线
由图 1 可知，LM90 在培育 8 h 后进入对数生长期，生长快速并持续至 16 h， 16～20 h 进入稳定期，20 h 后则进入衰亡期；活菌计数法测得的细菌生长类似于线性增长趋势，16 h 后略有下降，与 D600 nm 值变化趋势略微有差异，由于D 值测出的是细菌总数，其中包括死亡的细菌，在对数生长期死亡的细菌极少，可无视不计。因此，争论时可选用培育 14～18 h 的细菌。
不同接种量对 LM90 生长的影响
由图 2 可知，接种菌液浓度越高，菌种对应的生长延滞期越短。接种量为 1×107 CFU/mL 时，其生长延滞期为 0～6 h，接种量为 1×105 CFU/mL 时，其生长延滞期为 0～10 h，接种量为 1×103 CFU/mL 时，其生长延滞期为 0～14 h，接种量为 1×10 CFU/mL 时，其生长延滞期为 0～18 h。
温度、NaCl 浓度及 pH 对 LM90 生长特性的影响
温度 由图 3A 可知，4～20 ℃时，菌液的 D600 nm 值增长极其缓慢； 20～37 ℃时，随温度的上升 D600 nm 值渐渐增大，37 ℃时最大；而后随着温度的上升 D600 nm 值渐渐降低，至 45 ℃降至最低。因此，LM 生长的最适宜温度为 37 ℃。
NaCl 浓度 由图 3B 可知，在 NaCl 浓度为 %～%时，随着浓度的增
加，菌液的 D600 nm 值渐渐降低。%～4%时，D600 nm 值均高于 ，说明在此浓度范围内，菌株生长极好；在 4%～%时，D600 nm 值明显下降，说明在此浓度范围内，LM90 的生长受到抑制。但当 NaCl 浓度高于 %时，菌液的D600 nm 较小，说明 LM 受高浓度 NaCl 抑制效果显著。
pH 由图 3C 可知，当 pH= 时，菌液 D600 nm 最高；而 pH< 或pH> 时，LM90 的生长均受明显影响，生长极其微弱；当 pH 范围在 ～ 时，菌液 D600 nm 值随着 pH 的增加而渐渐增大，当 pH= 时达最大，之后随着 pH 的增加 D600 nm 值渐渐降低。
双因素对 LM90 生长的交互作用
温度和 pH 由表 1 可知，随温度与 pH 的上升，LM90 的 D600 nm 值先上升后降低，当温度为 30 ℃、pH=7 时 D600 nm 最大，为 。由表 2 可知，
温度的 F 值为 ，pH 的 F 值为 ，温度与 pH 的交互作用 F 值为 ， 三者均达极显著水平(P<)，说明温度、pH 及其交互作用对 LM90 的生长有极显著的影响。
NaCl 浓度和温度 由表 3 可知，NaCl 浓度和温度对 LM90 生长影响作用较
大，当 NaCl 浓度为 3%、温度为 40 ℃时，LM90 的 D600 nm 值最大，为 。由表 4 可知， NaCl 浓度F 值为 ，温度的 F 值为 ，NaCl 浓度与温度
的交互作用 F 值为 ，三者均达极显著水平(P<)，说明 NaCl 浓度、温度及其交互作用对 LM90 的生长有极显著的影响。
NaCl 浓度和 pH 由表 5 可知，一样 pH 条件下，D600 nm 值随着 NaCl 浓度的上升呈规律性下降趋势；而 NaCl 浓度肯定时，D600 nm 值随 pH 的上升(6～8)变化不明显，pH=9 时 D600 nm 值有所下降。由表 6 可知，NaCl 浓度的F 值为 ，pH 的 F 值为 ，NaCl 浓度与 pH 的交互作用的 F 值为
，三者均达极显著水平(P<)，说明 NaCl 浓度、pH 及其交互作用对
LM90 的生长有极显著的影响。
LM 广泛存在于土壤、污水、动物性食品及饲草等环境中，这与 LM 抗环境应激的简单作用机制亲热相关[13]。近年来诸多争论者多聚焦于 LM 抗环境应激的分子作用机制争论[2，14-15]，包括体外培育时常见环境因子对 LM 生长的影响。争论说明，0～20 ℃时，LM 菌液的 D600 nm 值增长缓慢，其最适生长温度为
37 ℃[16-17]；LM 在 NaCl 浓度为 %～%时生长良好，而当 NaCl 浓度高于 %时，LM 的生长明显受到抑制[18]；LM 在低酸环境中不易生长，其最适生长 pH 为 [19]。本争论结果觉察，在适温条件下(37 ℃)，不同的接种剂量对LM90 的生长周期影响较大，初始接种量存在对 LM90 生长起点的影响，此外还可能与细胞间的相互作用有关，其具体作用机制还有待于进一步探讨。本争论中选
择 4 和 45 ℃作为低温与高温的临界值，在此范围内测定温度对 LM90 生长的影响， 结果觉察 LM90 最适生长温度为 37 ℃，与张培培等[16]争论结果全都。王旭等
[20]在争论 LM 在不同 pH 条件下的动力学时觉察，LM 生长耐受的 pH ～，最适 pH 为中性至弱碱性，与本试验结果全都。据此可推断，LM90 在中性或偏碱性环境中生长良好。LM 对盐有较高的耐受性，可在浓度高于 10%的NaCl 溶液中生长，本试验觉察,当 NaCl 浓度高于 %时，菌液的 D600 nm 值急剧变小，说明 LM90 对 NaCl 耐受的临界值为 %。温度、pH、NaCl 浓度两两交互试验觉察，各因素的交互作用都对 LM90 的生长极显著，说明温度、pH、NaCl 浓度及其协同作用对 LM90 的生长有显著的影响，这与周小红等[21]争论环境因子对 LM 生长/非生长界面的影响结果相全都。综上所述，适当降低生长温度和 pH，提高培育基的盐度均可有效抑制 LM 的生长，这将大大有益于食品德业安全生产工艺的改进。
本争论初步探讨了温度、pH、NaCl 浓度等常规环境因子对 LM90 生长的影响，
并就其交互作用进展了方差分析，觉察温度、pH、NaCl 浓度及其协同作用对
LM90 的生长有显著的影响，为进一步探讨环境因素对 LM 的影响及 LM 抗环境胁迫的作用机制奠定了根底。
*通信 蒋建军(1972-)，男，江西人，博士，副教授，争论方向：免疫遗传与抗病机理，E-mail：*********************.cn 王鹏雁(1971-)，女，山东人，博士，副教授，争论方向：免疫遗传与抗病机理，E-mail：*****************
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