文档介绍：实验三酵母醇脱氢酶的提纯及其性质的研究
醇脱氢酶(ADH)是生物体内重要的氧化还原催化剂之一,在生物催化、生物医学领域都有较为广泛的应用。生物体内的很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。醇脱氢酶来源广泛,种类繁多,可按肽链长度分为短链、中链、长链醇脱氢酶,所含肽链氨基酸残基数分别为250、375和600~750,酵母醇脱氢酶(YADH)是其中研究和应用最为广泛的一种。酵母醇脱氢酶以NAD+/NADH为辅酶,可逆催化醇和醛/酮之间的氧化还原反应。酵母醇脱氢酶为四聚体,单个亚基肽链含347个氨基酸残基,亚基相对分子质量为35 000。
(一)酵母醇脱氢酶的提纯
一、实验目的
1. 学习和掌握醇脱氢酶提纯的原理和方法;
2. 掌握醇脱氢酶活力的测定方法。
二、实验原理
以酵母为原料,利用热变性、有机溶剂沉淀蛋白质等方法,提取具有一定纯度的酵母醇脱氢酶。在提纯过程中,每经一步提纯处理,都需测定酶蛋白质含量和活力,并计算得比活力(本实验中比活力=活力单位数/mg蛋白质)。唯有比活力提高了,才证明所用提纯措施有效,酶制剂的纯度提高了。
醇脱氢酶的辅酶NAD(以NAD为辅酶的醇脱氢酶,它只作用于一级醇、二级醇和半缩醛脱氢酶,动物醇脱氢酶还能催化环一级醇脱氢,酵母醇脱氢酶无此活力。另有以NADP为辅酶的醇脱
氢酶,它只作用于一级醇。),它能催化乙醇脱氢变成乙醛,脱下的氢则使NAD+还原。
CH3CH2OH+NAD+→CH3CHO+NADH+H+
当有过量的醇存在时,NAD+ 被还原的速度与酶活力成正比,酶活力愈高,单位时间产生的NADH愈多。NADH对340nm紫外线有较强吸收,NAD+ 无此能力,因此可用测定A340nm的方法测得反应体系中NADH含量,从而得知酶活力的大小。0
本实验用Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
三、实验材料、仪器和试剂
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(1)干酵母粉:将鲜酵母分散成小块,放在搪瓷盘吹干。干燥后,研磨成粉末。
(2)烧杯
(3)、、1ml、2ml、5ml
(4)容量瓶
(5)试管
(6)量筒
(7)水浴锅
(8)台天平
(9)电子天平
(10)离心机(5000r/min)
(11)722型分光光度计
(12)UV-900型紫外可见分光光度计
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(1)3mol/L 乙醇溶液:量取无水乙醇(比重:,相对分子质量:),加蒸馏水稀释至1000ml。
(2) 焦磷酸钠溶液():称取焦磷酸钠(Na4P2O2·10 H2O),溶于蒸馏水,稀释至1000ml。
(3) NAD溶液:称取NAD (NAD相对分子质量:)溶于蒸馏水,稀释至1000ml。
(4) 磷酸氢二钾溶液: K2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml。
丙酮(.)
磷酸氢二钠溶液: Na2HPO4于蒸馏水并稀释至1000ml。
四、实验操作步骤

(1)粗提
置20g干酵母于250ml烧杯中, Na2HPO4溶液80ml,37℃水浴锅保温2h,