文档介绍：中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
发布
××××-××-××实施
××××-××-××发布
鸡白血病检疫技术规范
Quarantine Protocol for Avain Leukosis
(征求意见稿)
SN/T ××××—××××
SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
前言
本标准按照GB/T -2009给出的规则起草。
本标准代替SN/T 1172-2003《鸡白血病检测方法琼脂免疫扩散试验》。
本标准与SN/T 1172-2003相比,主要技术变化如下:
——增加了白血病的病毒分离与鉴定
——增加了聚合酶链式反应
——增加了荧光定量聚合酶链式反应
——增加了酶联免疫吸附试验
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。
本标准主要起草人:叶奕优、杨俊兴、曹琛福、陶虹、唐金明、刘建利、阮周曦、卢体康、花群义。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为:
——SN/T 1172-2003
鸡白血病检疫技术规范
1 范围
本标准规定了鸡白血病的病毒分离与鉴定、聚合酶链式反应、荧光定量聚合酶链式反应、酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验的技术要求。
本标准适用于鸡白血病的检验检疫。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18088-2000 出入境动物检疫采样
GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2123-2008 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范
3 缩略语
ALV:鸡白血病病毒
PCR:聚合酶链式反应
ELISA:酶联免疫吸附试验
AGID:琼脂扩散试验
CEF:鸡胚成纤维细胞
TMB:3,3',5,5'-四***联苯***
PBS:磷酸缓冲液
4 病毒分离与鉴定
试剂和材料
主要试剂:DMEM细胞培养液、%胰酶、青霉素(10万IU/mL)、链霉素(10万IU/mL)、胎牛血清、细胞裂解液。
主要仪器设备和器材:细胞培养箱、倒置显微镜、酶标仪、离心机、研磨器、细胞培养瓶。
细胞和细胞株:鸡胚成纤维细胞(见附录C)、鸡胚成纤维细胞自发永生株(
DF1细胞株)。
样品的采集:主要采集鸡全血、组织样品(脾脏、肝脏和肾脏)或喉拭子、泄殖腔拭子。
样品的处理:
全血:采集全血样品后,置室温约30min,使血液自然凝固。5000 r/min离心10 min,收集上清液。
组织样品:按组织样品质量的5倍加入生理盐水(含终浓度为200IU/mL的青霉素和链霉素),研磨或破碎至匀浆状态,5000 r/min离心10 min,收集上清液。
拭子:将采集的喉拭子或泄殖腔拭子,(含终浓度为200IU/mL的青霉素和链霉素)的离心管中,剧烈振荡,5000 r/min离心10 min,收集上清液。
:用PBS(-)稀释细胞悬液,细胞浓度达到106个/mL,反复冻融3次,5000 r/min离心20min,收集上清。
病毒的分离培养
:(上清),接种单层DF1细胞,置37℃培养箱培养2h,弃去接种物,用基础细胞培养液洗一次,加入维持液,置于37℃培养箱培养5~7d。
:,置于37℃培养箱培养5~7d,盲传2~3代。
病毒鉴定可使用PCR(见5)、荧光定量PCR方法(见6)或ELISA方法()。
5 聚合酶链式反应(PCR)
试剂和材料
:十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶K、苯酚、三***甲烷、异戊醇、无水乙醇、PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、琼脂糖、DNA marker。
:PCR仪、离心机、电流仪、电泳槽、凝胶成像系统、-20℃冰箱。
对照样品:灭活ALV作为阳性对照,由指定单位提供。CEF或DF1细胞培养物可作为阴性对照。
:
根据GenBank上已发表的ALV不同亚***ol基因序列,设计一对引物, P1:5′-CTAACGAG GCGAGGGAATG-3′; P2: 5′-TTGGTGGGTTGGGTGGAGA-3′,