文档介绍：SDS-PAGE 电泳技术分析鱼类不同组织中的总蛋白
SDS-PAGE凝胶的制备
SDS-PAGE电泳
凝胶染色和脱色
电泳及基本原理
电泳(electrophoresis):
带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动
影响因素:泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比,与颗粒大小和介质粘度成反比
常用电泳种类有:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)、双向电泳等等
瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台自由电泳仪,建立了移界电泳法,成功地将血清蛋白分成白蛋白、a1-、a2-、b-和g-球蛋白五种主要成分,为人们了解血清奠定了基础,并由此获得1948年诺贝尔奖
电泳的用途:分离和鉴定蛋白质
分离蛋白
鉴别蛋白质的纯度和亚单位
半定量测定蛋白质的浓度
结合凝胶过滤层析可用来测定蛋白质的分子量和聚合状态;结合Western Blot、免疫共沉淀等方法可用来鉴别蛋白质相互作用;结合质谱分析可用来测定蛋白质序列;结合原核细胞蛋白表达系统可用来进行抗原制备等~~
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(acrylamide,Acr)和交联剂N’N’-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide, Bis)以29:1的比例在聚合剂过硫酸铵(ammonium persulfate,APS)和催化剂TEMED的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
优点:
凝胶孔径可调节(改变单体和交联剂的浓度),因此可根据被分离物的分子量范围选择合适的浓度
灵敏度可达1mg
分辨率高,可分离大小相差仅3%的多肽。尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体
无电渗作用,只要纯度高,操作条件一致,样品分离重复性好
凝胶透明,有弹性,机械效能好
化学性能稳定,与分离物不发生化学反应; 对pH和温度变化较稳定
PAGE 电泳原理
分子筛效应: 分子大小和形状
电荷效应:,表面负电荷多的蛋白质迁移快,反之则慢
(强阴离子去污剂SDS使蛋白结构松散,并带上大量负电荷,导致本身电荷差别消失,因此SDS-PAGE分离蛋白主要依赖分子大小,而非电荷或形状)
不连续系统具有对样品的浓缩效应
pH值的不连续
缓冲液离子成分的不连续
电位梯度的不连续
凝胶浓度的不连续以及电压的不连续.
80V
SDS-PAGE电泳
130V
分离胶
浓缩胶(积层胶)
配胶液
H2O
Tris-HCl
Acr/Bis
SDS
APS
TEMED
电泳液
H2O
Tris-HCl
Glycine
4-6% Acr
7-15% Acr
不连续电泳系统:
凝胶浓度、缓冲液pH、离子成分及电位梯度
()
—
+
分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系
浓缩胶的作用:
浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界,而电泳液()中的甘氨酸分子则组成尾随边界,在移动界面的两边界之间是电导较低而电位梯度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移,样品夹在前导和尾随离子界面之间,使样品浓缩,并在分离胶前沿积聚。
分离胶的作用:分子筛和电荷效应
,甘氨酸离子化,迁移率超过蛋白质,穿过堆积的多肽并紧随氯离子之后泳动。SDS多肽复合物从电位梯度界面中解脱开来,在电位和pH值均匀的区段泳动,依MW大小得到分离。
Acr/Bis %
线性分离
范围 kDa
15
12
10

5
10-43
12-60
20-80
36-94
57-212
分离胶
(7-15%, )
浓缩胶
(4-6%, )
加样
加电场,样品浓缩在界面上
电泳结束
—
+
封胶条
梳子
平、凹玻板
斜楔板
电泳槽
DYCZ-24D型垂直板电泳槽
聚丙烯酰胺凝胶的配制
贮液分离胶(10%) 浓缩胶(5%)
ddH2O ml ml
30% Acr/Bis ml ml
Tris ml /
1 M Tris / ml
10% SDS 100 ml 40 ml
10% APS 100 ml 40 ml
TEMED 4 ml 4 ml
Total volume 10ml 4 ml
20-37℃ 30-45min
20-37℃ 20-30min
按表中的顺序加入各溶液
每加入一种溶液,立刻混匀
TEMED加入之后聚合反应开始,应立即混匀并灌胶
聚丙烯酰胺具有很强的神经毒性,应带手