文档介绍：电转法将DNA导入哺乳动物细胞核中
一、实验目的
掌握Nucleofection(TM)电转法转染细胞的基本原理和技术要点。
二、实验原理
Nucleofection(TM)电转染技术是德国Amaxa公司的专利技术,在特定的细胞核转染溶液中,通过应用电穿孔技术将外源核酸直接导入真核细胞的细胞核内的转染方法。该技术十分有利于促进外源DNA或siRNA等高效率转染靶细胞,可在数小时内完成整个转染和分析的过程,从而促进通过过表达或干涉手段分析基因功能的研究。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)由283个氨基酸残基组成,最早从华盛顿星期五港水域的维多利亚水母体内克隆得到。后来发现其他品种的水母也存在类似的荧光蛋白。GFP的荧光团是Ser-65,Tyr-66和Gly-67形成的环状结构。GFP通过自催化氧化反应产生荧光团,这一催化反应在GFP翻译后约4小时进行,人工诱变的GFP可以缩短这一时间间隔。由于荧光蛋白在医学、生物学领域的广泛应用,该技术被授予2008年度诺贝尔奖。其中利用GFP真核表达质粒转染哺乳动物细胞,可在荧光显微镜下直观地检测转染效率。
三、实验仪器、材料和试剂
(一)仪器、用具:电转仪、电击杯、CO2培养箱、35mm细胞培养平板、微量移液器、小试管、烧杯、量筒等。
(二)材料:呈指数生长的真核细胞HepG2,可以表达绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达质粒。
(三)试剂:
1)完全培养液(100ml):
DMEM 90ml
胎牛血清 10ml
2) 电转液:
Solution Ⅰ(10ml):
2g ATP-Disodium salt (ATP-二钠盐)
MgCl2 6H2O
滤器过滤除菌,-20℃保存。
SolutionⅡ(500ml):
6g KH2PO4
NaHCO3
葡萄糖
。,-20℃保存。
使用前将80ul solutionⅠ和4ml solution Ⅱ混合,在4℃可以存放一个月。
3)PBS 800ml水中溶解 8g NaCl; KCl; Na2HPO4, KH2PO4,,定容1000ml,存于室温。
4)青霉素、链霉素各一瓶。
5)胰酶,%,溶于PBS缓冲液中。
四、方法与步骤
1 在培养瓶中培养细胞,密度达到70%-80%融合。
将电转液预热至室温。
向35 mm孔板中加入2ml按比例混合的培养基与血清并置于37℃培养箱。
取培养的细胞,弃去培养瓶中的培养基,胰酶消化后收集细胞。
取细胞悬液进行细胞计数。
取1×106cell,200g离心10min,弃上清(尽量不要残留培养基)。
用100ul电转液在试管内重悬细胞。
向电转液中加入5ug质粒DNA,轻轻混合均匀。
将混合液移至电击杯中。
将电击杯置于电转仪中,选择程序T-28进行电转。
电转结束后,立即将混合液取出并加入到事先准备好的6孔板中、置于37℃培养。
24小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。
五、注意事项
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