文档介绍：第四章目的基因的分离与合成
通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为“外源基因”
将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DN***段,称为“目的基因”。
获得目的基因进行分子克隆,一方面为了获得表达产物,另一方面就是要获得大量拷贝,以便进行基因结构和功能的研究
5/9/2018
苏州科技学院生物系叶亚新
第四章目的基因的分离与合成
获得目的基因的方法:
限制酶直接分离
从基因组文库中筛选
逆转录制备cDNA或从cDNA文库中筛选
人工合成
PCR扩增
基因改造
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苏州科技学院生物系叶亚新
第四章目的基因的分离与合成
第一节限制酶直接分离
一、用于一些物理图谱已确定的、背景资料比较清晰的原核生物基因的制备
对已定序列的DNA分子
只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次的切割,分离纯化所需的DN***断,与适当的载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。
对已知定位的目的基因
只要根据目的基因两侧的已知酶切位点,用适当的酶切割,一次即可获得目的基因。
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苏州科技学院生物系叶亚新
第一节限制酶直接分离
二、用于一些物理图谱未确定的、背景资料不明的原核生物基因的制备
采用鸟枪法(shot gun):
从细菌细胞中分离细菌染色体
用机械切割或限制酶分解得到各种大小的基因片段
用相同的限制酶酶切载体质粒,与染色体片断连接输入到受体细胞
转化子的选择
5/9/2018
苏州科技学院生物系叶亚新
鸟枪法克隆目的基因的基本战略
染色体DNA的切断
超声波处理:片段长度均一,大小可控,平头末端
全酶切: 片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,
大小不可控
部分酶切: 片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整
与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载
体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为
转化受体细胞
受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达
的受体细胞
筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立)
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苏州科技学院生物系叶亚新
鸟枪法操作的改进
使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体DNA,然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高重组子中目的重组子的出现频率
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
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苏州科技学院生物系叶亚新
鸟枪法操作的改进
例如, kb的SalI片段中,将染色体DNA用SalI切开,琼脂糖凝胶电泳分离, - kb大小区域内的凝胶块,从此凝胶块中回收DN***段,然后与载体进行拼接
在连接前将DN***段进行分级分离
kb
kb
kb
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苏州科技学院生物系叶亚新
鸟枪法操作的改进
冻融法
滤纸法
吸附法
低融点凝胶法
溶解法
凝胶DN***段回收技术
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苏州科技学院生物系叶亚新