文档介绍：产酶微生物的分离、纯化与选育
实验目的
学****从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化;
通过实验观察紫外线和亚硝基胍等理化因素对微生物的诱变效应,并掌握基本方法;
实验原理
许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品(或其他样品)悬液加热处理,杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌,将其接种到酪蛋白平板进行培养,根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。
基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用,这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。
紫外线(UV)是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体,阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对,从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤,可由光复活酶的作用进行修复,使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此,为了避免光复活,用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行,并且照射处理后的微生物放在暗处培养。
试剂
距离地面十公分的土壤、酪素培养基
实验器材
恒温培养箱、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿×8、试管×11、玻璃棒、移液管、量筒、三角瓶、烧杯、滴管、涂布器、血细胞计数板、移液枪、显微镜、紫外线等(15W)、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器等
实验方法与步骤
酪素培养基的配置:牛肉膏3g、NaCl 5g,酪素 10g,琼脂 20g,水1000mL, pH -。配制方法:称取酪素4g,先用少量2%NaOH润湿,玻璃棒搅动,再加适量的蒸馏水,在沸水浴中加热并搅拌,至完全溶解,补足水量至1000mL,加入其他成分,调整pH值,灭菌备用。
菌悬液的制备取土壤20g,加水200ml,即梯度为10ˉ1的菌悬液,取1ml10ˉ1的菌悬液,加9ml的蒸馏水,即梯度为10ˉ2的菌悬液,按上述的方法步骤制作梯度为10ˉ3、10ˉ4、10ˉ5的菌悬液。将制作好的菌悬液做好标记,至温度为80℃的水浴锅热处理30min。
3、接种与培养:在超净台将上述经过热处理菌悬液按下表接种
接种梯度
10ˉ1
10ˉ2
10ˉ3
10ˉ4
10ˉ5
培养皿接种个数
1
2
2
2
1
菌悬液接种滴数
2
2
2
2
2
用涂布器涂均匀。放在温度为32℃恒温培养箱倒置培养48h。
4、菌种的选育:菌悬液的制备①取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面1支,取2环接入10 ml 无菌生理盐水菌中,倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中,振荡30分钟,以打碎菌块。②将上述菌液离心(3000 r/min,离心15分钟),弃去上清液,将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次,最后制成菌悬液。③用显微镜直接计数法计数,调整细胞浓度为每毫升108个。平板制作:将淀粉琼脂培养基溶化后,冷至55℃左右时倒平板27套,凝固后待用。紫外线处理:①将紫外线灯开关打开,预热约20分钟。②取直径6cm无菌平皿2套,分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml,并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。③将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上,打开皿盖,在距离为30cm,功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。盖上皿