文档介绍：大肠杆菌表达体系
克隆基因正确表达的基本条件
克隆基因表达活性的检测
真核基因的大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系
优越性:
1. 对大肠杆菌的背景知识,特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解;
2. 是一种安全的基因工程实验体系,拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体;
3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达;
4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉,易用于批量生产。
大肠杆菌中表达体系的不足:
1. 真核基因,在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。
2. 真核基因的转录信号同原核的不同。
细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子;外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。
3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异,影响真核基因mRNA稳定性。
4. 许多真核基因的蛋白质产物,都要经过转译后的加工修饰(正确折叠和组装),而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在;
5. 细菌的蛋白酶,能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子,并把它们降解掉。
克隆基因正确表达的基本条件
最基本条件:应该能够进行正常的转录和转译,以及在正常情况下还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。
重要条件:编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。
具有核糖体结合位点;
具有克隆基因的功能(强)启动子;
插入序列的正确取向。
真核基因在大肠杆菌中的表达
克隆基因表达活性的检测
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微细胞检测法:
这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。
微细胞:指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小的圆形的无核细胞。