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摘要
酪氨酸酶基因（tyr）是调控黑色素合成的关键基因，其表达水平直接影响生物体的色素表型。本研究旨在建立基于CRISPR-Cas13d系统的青鳉tyr基因表达下调技术体系，为青鳉基因功能研究及色素相关疾病模型构建提供新工具。通过设计针对青鳉tyr基因的特异性向导RNA（sgRNA），构建Cas13d-sgRNA表达载体，采用显微注射技术将其导入青鳉受精卵，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测tyr基因的mRNA表达水平，通过表型观察分析黑色素合成情况，并结合Western blot验证酪氨酸酶蛋白的表达变化。结果显示，与对照组相比，注射Cas13d-sgRNA表达载体的实验组青鳉胚胎及幼鱼中tyr基因的mRNA表达水平显著降低（P<），酪氨酸酶蛋白表达量明显下降，且幼鱼出现眼部和体表黑色素沉着减少的表型。本研究成功利用CRISPR-Cas13d系统实现了对青鳉tyr基因表达的高效下调，证明该系统在青鳉基因表达调控中具有良好的适用性，为后续青鳉功能基因组学研究提供了重要技术支撑。
关键词
CRISPR-Cas13d；青鳉（Oryzias latipes）；tyr基因；基因表达下调；黑色素合成
1 引言
青鳉（Oryzias latipes）作为一种小型淡水硬骨鱼，具有繁殖周期短、胚胎透明、基因组序列明确等优点，已被广泛应用于发育生物学、毒理学及遗传学等领域的研究[1]。黑色素作为生物体重要的色素之一，不仅在视觉保护、体温调节等方面发挥重要作用，其合成异常还与多种人类疾病相关，如白化病等[2]。酪氨酸酶（tyrosinase）是黑色素合成通路中的关键限速酶，由tyr基因编码，其活性或表达水平的改变会直接导致黑色素合成异常[3]。因此，建立高效的青鳉tyr基因表达调控技术，对于研究黑色素合成机制及相关疾病模型构建具有重要意义。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）-Cas系统是近年来发展起来的一种新型基因编辑技术，凭借其高效、简便、低成本的优势，已在多种生物中得到广泛应用[4]。与主要作用于DNA水平的Cas9、Cas12等系统不同，Cas13d是一种RNA靶向的Cas蛋白，其通过向导RNA（sgRNA）识别并结合靶标mRNA，随后切割靶标RNA，从而在转录后水平实现基因表达的下调[5]。相较于RNA干扰（RNAi）技术，CRISPR-Cas13d系统具有更高的特异性和靶向效率，且不易产生脱靶效应和免疫反应[6]。目前，CRISPR-Cas13d系统已在哺乳动物、昆虫等生物中成功实现了基因表达的调控，但在青鳉中的应用尚未见系统报道。
本研究以青鳉tyr基因为靶标，设计并构建CRISPR-Cas13d-sgRNA表达载体，通过显微注射技术导入青鳉受精卵，从mRNA水平、蛋白水平及表型水平验证该系统对青鳉tyr基因表达的下调效果，旨在建立CRISPR-Cas13d介导的青鳉基因表达调控技术体系，为青鳉基因功能研究及相关应用提供新的技术手段。
2 材料与方法
实验材料
实验动物
野生型青鳉（Oryzias latipes，东京品系）由本实验室人工养殖，饲养条件为水温26±1℃，光周期14h光照/10h黑暗，投喂丰年虾幼虫，每日2次。选取健康的性成熟青鳉作为亲鱼，用于收集受精卵。
主要试剂与仪器
pCAG-Cas13d-EGFP载体（Addgene，货号：109049）；限制性内切酶BsaⅠ（NEB，货号：R0535L）；T4 DNA连接酶（Thermo Scientific，货号：EL0011）；RNA提取试剂盒（TaKaRa，货号：9767）；逆转录试剂盒（TaKaRa，货号：RR047A）；实时荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa，货号：RR820A）；酪氨酸酶抗体（Abcam，货号：ab15090）；HRP标记的二抗（Abcam，货号：ab6721）；显微注射仪（Eppendorf，型号：FemtoJet
4i）；实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad，型号：CFX96）；Western blot电泳仪及转膜仪（Bio-Rad，型号：Mini-PROTEAN Tetra）；体视显微镜（Olympus，型号：SZX16）。
实验方法
青鳉tyr基因序列分析及sgRNA设计
根据GenBank中公布的青鳉tyr基因序列（登录号：），利用在线工具CRISPRdirect（/）设计sgRNA。设计原则如下：靶标序列长度为22nt，位于tyr基因的编码区（CDS），且靠近起始密码子区域；避免出现连续的重复序列及高GC含量区域（GC含量控制在40%-60%）；通过BLAST比对确保sgRNA序列在青鳉基因组中无同源性较高的非靶标位点，以降低脱靶风险。最终选取3条特异性sgRNA，分别命名为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3，其序列如下：
- sgRNA1：5’-GGAACAGAGCGTCGTCATCGAA-3’
- sgRNA2：5’-CGTCATCGAAGCCGTCGTGGA-3’
- sgRNA3：5’-GCCGTCGTGGAGATGGTGGA-3’
同时设计一条无关序列的sgRNA作为阴性对照（NC-sgRNA），序列为：5’-TTGATGCGTTCGTAGACGTAAT-3’。
Cas13d-sgRNA表达载体的构建
将设计好的sgRNA序列两端分别添加BsaⅠ酶切位点的互补序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成单链DNA oligonucleotide。将合成的单链oligo进行退火形成双链DNA（dsDNA），反应体系为：正向oligo（100μmol/L）1μL，反向oligo（100μmol/L）1μL，10×Annealing Buffer 2μL，ddH₂O 16μL，反应条件为95℃保温5min，然后自然冷却至室温。
使用BsaⅠ对pCAG-Cas13d-EGFP载体进行酶切，酶切体系为：pCAG-Cas13d-EGFP载体（1μg/μL）2μL，BsaⅠ（10U/μL）1μL，10×CutSmart Buffer 2μL，ddH₂O
15μL，37℃孵育2h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，利用胶回收试剂盒回收线性化的载体片段。
将退火后的dsDNA与线性化的pCAG-Cas13d-EGFP载体进行连接，连接体系为：线性化载体1μL，dsDNA 2μL，T4 DNA连接酶（5U/μL），10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，ddH₂O ，16℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基上，37℃培养12-16h。挑取单菌落进行培养，提取质粒后进行BsaⅠ酶切鉴定及测序验证，确保sgRNA正确插入载体，鉴定正确的载体分别命名为pCAG-Cas13d-sgRNA1-EGFP、pCAG-Cas13d-sgRNA2-EGFP、pCAG-Cas13d-sgRNA3-EGFP及pCAG-Cas13d-NC-sgRNA-EGFP。
青鳉受精卵的收集与显微注射
选取健康的青鳉亲鱼，按照雌雄比例1:2放入繁殖缸中，次日清晨收集新产出的受精卵。在体视显微镜下挑选发育正常、卵膜完整的受精卵，用于显微注射。
将构建好的Cas13d-sgRNA表达载体用无内毒素质粒提取试剂盒提取，并用无菌水调整浓度至200ng/μL。采用显微注射仪将载体溶液注射到青鳉受精卵的细胞质中，注射量约为1nL/卵。实验分为5组：空白对照组（未注射任何物质）、阴性对照组（注射pCAG-Cas13d-NC-sgRNA-EGFP载体）、sgRNA1组（注射pCAG-Cas13d-sgRNA1-EGFP载体）、sgRNA2组（注射pCAG-Cas13d-sgRNA2-EGFP载体）、sgRNA3组（注射pCAG-Cas13d-sgRNA3-EGFP载体），每组注射50枚受精卵。注射后的受精卵置于26±1℃的无菌水中培养，每日更换1/2的水，观察并记录胚胎的发育情况。
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测tyr基因mRNA表达水平
分别收集注射后3d的青鳉胚胎（每组30枚）及注射后14d的幼鱼（每组15尾），按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。使用Nanodrop 2000检测RNA的纯度（A260/-）和浓度，并用1%琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性。
以提取的总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。反应体系为：总RNA 1μg，Oligo(dT)18 Primer（50μmol/L）1μL，Random 6 mers（100μmol/L）1μL，5×PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1μL，ddH₂O补足至20μL，反应条件为37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。
根据青鳉tyr基因序列及内参基因β-actin序列（登录号：），利用Primer Premier -PCR引物，引物序列如下：
- tyr-F：5’-GCTGCTGCTGCTGATGTTCT-3’
- tyr-R：5’-CAGCAGCAGCAGCAGATGTT-3’（产物长度：150bp）
- β-actin-F：5’-GAGCAAGAGAGGTATCCTGAC-3’
- β-actin-R：5’-GATGATCTTGATCTTCATGGTG-3’（产物长度：180bp）
qRT-PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，反应体系为：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μL，上下游引物（10μmol/L），cDNA模板2μL，ddH₂O ，总体系20μL。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环；最后进行熔解曲线分析，以验证引物的特异性。每个样品设置3个技术重复，采用2^(-ΔΔCt)法计算tyr基因的相对表达量，数据用SPSS （ANOVA），P<。
Western blot检测酪氨酸酶蛋白表达水平
收集注射后14d的青鳉幼鱼（每组10尾），加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），在冰浴条件下研磨成匀浆，4℃下12000rpm离心15min，收集上清液，即为总蛋白提取液。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将各样品的蛋白浓度调整至一致。
取20μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳（分离胶浓度10%，浓缩胶浓度5%），电泳条件为：浓缩胶80V 30min，分离胶120V 90min。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上，转膜条件为200mA恒流2h。转膜完成后，用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜，室温摇床孵育2h。封闭后的膜加入一抗（酪氨酸酶抗体，稀释比例1:1000），4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，然后加入二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG，稀释比例1:5000），室温摇床孵育1h。再次用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，最后用ECL化学发光试剂盒显色，通过凝胶成像系统（Bio-Rad，型号：ChemiDoc
XRS+）采集图像，并使用ImageJ软件对蛋白条带的灰度值进行定量分析，以β-actin作为内参蛋白，计算酪氨酸酶蛋白的相对表达量。
青鳉幼鱼色素表型观察
在注射后7d、14d、21d，利用体视显微镜观察各组青鳉幼鱼的眼部和体表色素沉着情况，选取典型个体进行拍照记录。采用ImageJ软件对幼鱼眼部黑色素区域的灰度值进行定量分析，灰度值越高表示黑色素沉着越少，数据进行统计学分析，比较各组间的差异。
3 结果
Cas13d-sgRNA表达载体的鉴定结果
对构建的Cas13d-sgRNA表达载体进行BsaⅠ酶切鉴定，结果显示，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，出现了与预期大小一致的线性化载体片段和sgRNA插入片段（约66bp），表明sgRNA已成功插入载体（图1）。测序结果进一步证实，插入的sgRNA序列与设计序列完全一致，无碱基突变或缺失，说明Cas13d-sgRNA表达载体构建成功。
（此处应有图1，图注：Cas13d-sgRNA表达载体的酶切鉴定结果。M：DNA分子量标准；1：pCAG-Cas13d-sgRNA1-EGFP载体酶切产物；2：pCAG-Cas13d-sgRNA2-EGFP载体酶切产物；3：pCAG-Cas13d-sgRNA3-EGFP载体酶切产物；4：pCAG-Cas13d-NC-sgRNA-EGFP载体酶切产物）
CRISPR-Cas13d系统对青鳉tyr基因mRNA表达水平的影响
qRT-PCR结果显示，在注射后3d的胚胎中，与空白对照组和阴性对照组相比，sgRNA1组、sgRNA2组、sgRNA3组的tyr基因mRNA相对表达量均显著降低（P<），其中sgRNA2组的下调效果最为显著，%；%%；而阴性对照组与空白对照组之间的tyr基因mRNA表达水平无显著差异（P>）（图2A）。
在注射后14d的幼鱼中，各实验组的tyr基因mRNA表达水平变化趋势与胚胎期一致。sgRNA2组的tyr基因mRNA相对表达量仍最低，%；%%；阴性对照组与空白对照组之间无显著差异（P>）（图2B）。上述结果表明，CRISPR-Cas13d系统能够有效下调青鳉tyr基因的mRNA表达水平，且不同sgRNA的下调效率存在差异，其中sgRNA2的靶向效率最高。
（此处应有图2，图注：CRISPR-Cas13d系统对青鳉tyr基因mRNA表达水平的影响。A：注射后3d胚胎中tyr基因mRNA相对表达量；B：注射后14d幼鱼中tyr基因mRNA相对表达量。数据以“平均值±标准差”表示，n=3；*表示与空白对照组相比P<；ns表示无显著差异）
CRISPR-C