文档介绍：LDH法细胞毒性检测:
原理:乳酸脱氢酶在胞浆内含量丰富,正常时不能通过细胞膜,当细胞受损或死亡时可释放到细胞外,所以细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比,用比色法测定实验孔LDH 活性,并与靶细胞对照孔进行比较,可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率
LDH(乳酸脱氢酶)是一种极为稳定的细胞质酶,存在于正常细胞的胞质中,一旦细胞膜受损,LDH即被释放到细胞外; LDH催化乳酸形成***酸盐,和INT(四唑盐类)反应转化成红色甲臢化合物,可通过酶标仪进行检测。颜色形成的量与裂解细胞的数目成正比。应用一个96-孔平板读数计收集可见光波长的吸收值数据。这个分析可用于测量在细胞介导的细胞毒性分析中细胞膜的完整性,这种情况下目标细胞被效应细胞裂解,可判断细胞受损的程度。
乳酸脱氢酶(LDH)在胞质内含量非常丰富,细胞处于正常状态下其不能通过细胞膜,但当细胞受到损伤或死亡时便可释放到细胞外,此时细胞培养液中 LDH 的活性与细胞的死亡数目呈正比,通过用比色法测定并与靶细胞对照孔的 LDH 活性进行比较,可计算出效应细胞对靶细胞的杀伤百分数。该实验方法操作简便、快速,可应用于 CTL 和 NK 细胞活性测定及药物、化学物质或放射所引起的细胞毒性,目前已有 LDH 法测定 CTL 活性的试剂盒。
同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组
按5∶1、10∶1、20∶1(效应细胞∶靶细胞)
细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶
操作流程:
设立效应细胞孔(不同浓度的效应细胞设立效应细胞自发释放组):50μl效应细胞+50μl培养基
实验组:靶细胞不变,改变效应细胞:50μl效应细胞+50μl靶细胞
设立靶细胞自发释放组:50μl靶细胞+50μl培养基
设立靶细胞最大释放组:50μl靶细胞+50μl培养基+10μl裂解液(10×)
设立体积校正对照组:100μl培养基+10μl裂解液(10×)
设立背景对照组:100μl培养基
250g离心4分钟
37℃孵育4小时
离心前45分钟添加裂解液(10×)至靶细胞最大释放组
250g离心4分钟
取上清50μl转移至另一孔板
(可选)于独立的孔中加50μl LDH阳性对照(1:5000)
于每孔中添加50μl再次稀释的底物混合物
室温避光孵育30分钟
添加50μl终止溶液
490nm测吸收值
靶细胞接种数目的优化
设立检测板
准备靶细胞:调整细胞浓度0, 5,000, 10,000, 20,000/100μl,使用与细胞毒分析相同的培养基及孔板终体积。例如,若以50μl/孔的靶细胞及50μl/孔的效应细胞接种,则以100μl/孔梯度稀释。
设置不含细胞的背景对照组
可选:验证LDH阳性对照。使用涡旋混匀器轻轻混匀LDH阳性对照液,以1:5000稀释(稀释方法:取2μl原液至10ml的PBS+1%BSA)。使用与实验孔相同的体积。
细胞裂解及收获上清
裂解细胞每100μl培养基加10μl裂解溶液(10×)
37℃,5%CO2孵育45分钟
. 250g离心4分钟
. LDH检测
. 转移50μl上清至另一孔板
. 解冻检测缓冲液,取12ml