文档介绍：1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法:将核酸消化,测定其无机磷量,由此计算出核酸含量,反应灵敏。
2. 紫外吸收法:利用核酸在260nm处有吸收高峰,操作简便,受蛋白质和核苷酸的干扰影响。
3. 地衣酚法:用于测定RNA的含量,RNA与浓盐酸共热,降解形成的核糖转变为糠醛,利用地衣酚反应来测定,特异性差,戊糖均有此反应。
4. 二苯***法:DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟-γ-***基戊醛,利用二苯***试剂反应,除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。
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定磷法的原理
首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷,利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为:
(NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4
H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O
H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 • MoO3(钼蓝)
Vit • C
3
还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值,当无机磷含量在1—25μg 范围内,光吸收和含磷量成正比。
%,即1μg μg RNA。%。
4
试剂
酵母RNA样品溶液:2000μg/mL
标准磷原液:含磷量为1000 μg/mL
标准磷溶液:含磷量为10 μg/mL,每组用干试管取15mL
定磷试剂:含硫酸、钼酸铵、,浅黄色,如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
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实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化,将有机磷转化成无机磷;
2. 制定定磷标准曲线;
3. 测定回收率和样品总磷量。
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1. 样品消化(每两组或三组做一份)
消化管
1
2
3
RNA/mL
0
1
0
标准磷原液/mL
0
0
1
dH2O/mL
1
0
0
5mol/L H2SO4/mL
2
2
2
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明,冷却
dH2O/mL
1
1
1
沸水浴中加热10min(分解焦磷酸),冷却
用dH2O定容/mL
50
50
50
混匀
7
2. 定磷标准曲线的制定(每人做一份) 每人取18支试管,按照下表平行操作:
1
2
3
4
5
6
标准磷溶液/mL
0
dH2O/mL
定磷试剂/mL
用漩涡混合器混匀,45℃恒温水浴保温25分钟
用去离子水作为空白,660nm测定吸光值
A660(1)
A660(2)
A660平均值
A660平均值—空白
0
8
3. 测定总磷量和回收率(与2同时进行)
7(空白)
8(样品)
9(标准)
定容溶液/mL
dH2O/mL
0
0
定磷试剂/mL
用漩涡混合器混匀,45℃恒温水浴保温25分钟
A660(1)
A660(2)
A660平均值
A660平均值—空白
0
9
数据处理
关于空白:
1—6号管用于绘制定磷标准曲线,1号管作为空白。
7—9号管用于样品及回收率的测定,7号管作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标,吸光值为纵坐标画标准曲线,直线应过原点。
在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。
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计算回收率:
(2) 计算样品总磷量:
(3) 计算RNA量:
(4) 样品RNA含量: