文档介绍：实验四
肝脏DNA的粗提取
实验目的
掌握DNA提取的基本原理
熟悉DNA提取的操作步骤
实验原理
要获得DNA样品,必须考虑以下几点:
⑴如何选材,如何破碎组织细胞?
⑵如何除去蛋白质?在真核细胞内,DNA与蛋白质结合成核蛋白形式。因此,分离DNA时必须使其与蛋白质解离,并除去蛋白质。
⑶设法除去RNA的污染;
⑷防止DNA酶的降解作用。
(一)选材
要提取动物组织DNA,一般选择细胞膜较脆弱,容易破碎的动物脏器,如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏、精子等。
(二)细胞破碎方法:
机械物理法:研磨、组织捣碎、反复冻融法、超声波处理法等。
化学方法:有机溶剂,SDS。
(三)除去RNA的方法
脱氧核糖核蛋白在浓NaCl(1-2mol/L)溶液中溶解度很大, NaCl溶液中溶解度很低, NaCl溶液中,利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。
(四)除去蛋白质的方法
DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的,因此提取脱氧核糖核蛋白复合物-DNP后,必须将其中蛋白去除。
其中蛋白质部分可用SDS使之变性除去(同时破坏核酸分解酶)。
用氯仿一异戊醇混合液振荡核蛋白溶液,使蛋白质变性,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA溶于上层水相。用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。
(四) DNA的沉淀
乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般实验中,是加2倍体积的预冷的95%乙醇。
原则
低温:抑制DNA酶的活性
操作柔和:防止DNA断链