文档介绍：复旦大学
博士学位论文
Pichia pastoris表达重组人载脂蛋白ApoAI和D-氨基酸氧化酶
的研究
姓名:冯美卿
申请学位级别:博士
专业:药物化学
指导教师:周珮
20040425
表达重组人载脂蛋白和话被嵫趸傅难芯中文摘要第一部分奉沦文包括两部分内容,篇⋯’部分为厅啪拍泶镏刈槿嗽刂蛋白氖疛浚旱诙糠治狿表达话被嵫趸傅难芯俊饕4尤搜=竦茫尤搜=崛街瓒唷⒊杀靖撸苣咽迪职邢蛞┪锏牟祷矣捎谘R阂资芪廴臼谷们不愿接受人血制品。为了大量制备该蛋白,人们尝试利用基因工程系统表达达系统表达蛐蛄猩杓埔铮院烊缘闹柿为模板,通过竦帽嗦胩烊蝗嗽刂鞍譇凼片段,将其插入到户分泌型载体希缱;疨惺芴赴ɑ竦玫膖喔鲎;右来卧诤煌ǘ菺腨平的高抗性转化子。本研究即在此基础上将株高抗性菌进行表型鉴定,筛选和比较重组菌表达鉴定,显示重组茼所表达蛋白为1狙芯恐氐愎兄刈榫鶤呐养及诱导表达进行了优化,并在⒔凸弈谑凳┍泶锪薃∑磕冢又至课%,甘油浓度为サ奶跫掠欣谥刈榫纳ぃ体湿重达痬S盏脊讨校课ァ⒕迕芏萶N左右⒓状己课%、【表达量最商,表达水平达/!1炔质舐殉蚕赴斜泶顰人载腊蛋白足『『【兄匾5闹鞍祝渲饕3煞治T刂鞍譇。目前ň焕硐搿I蒲г核未笮陆淌谑紫瘸⑹岳肞F涓軬哪板筛选高抗性转化子,得到个可抗痬力,经摇瓶发酵、觳饣竦酶叻置诒泶镏刈榫鶤志璚=峁允荆涸痳侪,比钟江教授最新报道的昆虫杆状病毒表达/高%,复旦凡学怫宦畚珹
是目前困内外基因工程表达淖罡咚健1狙芯炕故紫瘸晒Φ卦发酵罐内实现了高密度培养,生长约辶湿重疞左右,再经诱泶锪看镒罡撸泶锼酱/7⒔凸弈诒泶顰操作简便,周期短,整个周期约纫∑恐辽偎醵。本研究的谋达为分泌表达,蛋白纯度高,占廴苄缘鞍椎ヒ陨希掷氪炕虮悖狼丈同学经低温丙酮分级沉淀一次性获得纯度高于%1韭畚闹刈锳成功的分泌表达且表达水平明显高于其它表达系统,再次显示了尸表达系统的优势,也为魑8卧喟邢蛞┪锏难芯俊⒅票负陀τ玫於嘶关键词:人载酯蛋门籔/;重组表达;导—珹复目人学悼上学位论文
头孢烷酸~半合成头孢菌素的主要原料。最早来源于动物的肾脏,第二部分。有文献报道表型更适于胞内表达,为此本论文重点构建了拗,表型醇诱导获得高表达重组菌覱/,肋圆。另将表达质粒而,三株重组菌诱导表达条件却不相同。在菌体密度相同的条件下,胁,对通风内最高活力达到、和/得餍补惚萂视诟呙芏确⒔汀被嵫趸珼是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸8ɑ牡湫突扑孛浮4嗣柑匾煨源呋疍氨基酸生成相应晁帷氨和:。已广泛应用丁被岬亩糠治觥⑸。更重要的应用是参与两步酶法转化头孢菌素生产话被后来主要由微生物获得,随着基因工程技术的发展,已在大肠杆菌、酿酒酵母中进行表达,但表达水平均不高,不能工业化生产。近年,作为表达系统显示了诸多优势,如含醇氧化酶子,可以在廉价的基础盐培养基内高密度发酵等。于健等采用僮骷际酰来源于三角酵母的基因插入甲醇酵母的表达载体希俳ū泶镏粒狣缱;琾秆』竦肕硇偷谋泶锞的重组菌。将表达质粒狣;疜;颖硇途狹>狾肂簂盖校厥沾笃不含转化竦不含编码荒邗0访富虻淖;樱蟛糠肿;游狹。经甲醇诱导获得高表达重组菌疓/,。对以上三株重组菌考察,比较蚆对表达的区别。结果显示:三株重组菌,,罴焉ぬ跫鞠嗨疲贐嘌诟视浓度均为ァ罽含量为%、生物素及微量元素最佳浓度分别为疞和疞,培养基起始为鄙な蔽饰,最有利于表达,菌密度约/。且在嘌诩拥鞍纂耍琁表达量明显提高。然量要求低,诱导珼盍Υ镒罡摺酝ǚ缌恳G蟾撸盏,活力达最高。研究中还发现表达量与菌体密度并不成正比,在同样相对高的菌密度下V卦嘉/曛刈榫琍琍摇瓶⒔凸藁盍Ψ直鸫锏、、和/盟绞悄壳氨ǖ赖幕珹强启动复口人学博十学位论文—
工程菌表达最高的。活力达到峰值的时间则分别是和,均比摇瓶缩短笥摇在上述研究基础上,本论文又对粗酶的催化性能做了初步观察,发现与底物反应的最适为,底物结构不同,酶催化能力不同。同时还利用该粗酶进行了初步应用实验,对荆槐奖彼峤凶;票副奖K岷蚅一苯丙氨酸。结果显示基凶工程菌表达的具有良好的转化一苯丙氨酸制备苯丙酮酸和奖彼岬哪芰Γ趐的焦磷酸缓冲液体系内,一苯丙氨酸与的混合物于。痬反应,一苯丙氨酸可完全转化为槐奖彼岷苯丙酮酸。但是上述构建的重组菌均为胞内表达,分离纯化较困难,尤其难与分子量柏近的过氧化氢酶分开,因此不能用于纳镒;N4吮狙芯抗建了可一步分离纯化的重组菌。方法是:根据虻羌呛盼蛐蛄泻妥榘彼岫杂Φ募罨蛄校杓屏艘欢訬端和烁骱个组氨酸的引物,并引入嘤γ盖形坏悖员泶镏柿..为模板,通过┰龌竦昧撕嗦胱榘彼峄虻腄蚱巍H缓蠼ǜ片段装入载体越欣┰觯┰龅膆尉瑽停疘、酶切克隆至用同样酶酶切的表达载体竦昧薔端和烁飨馇个组氨酸的重组质粒,用盖邢咝曰蟮缱;畃电感受态细胞,转化子经硇蜕秆⒀粜宰;蛹ǎ倬状加盏己突盍比较,筛选