文档介绍：嘌呤霉素筛选程序
杀伤曲线
1. 在24 孔板内接种细胞,约3x104/孔,共11孔,培养过夜。
2. 第二天,观察细胞密度为20%-30%。稀释嘌呤霉素(0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 µg/ml)至培养基, 。
3. 每隔2天观察细胞的存活情况(贴壁细胞飘起即为死亡,悬浮细胞,可以通过观察细胞的膜情况来判断,死亡细胞的细胞膜较为粗糙,有皱褶,没光泽,准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准),。
4. 筛选4-7天内使细胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度,即为杀伤浓度(筛选浓度);
细胞筛选
转染(24孔板进行)或电转后培养24小时,按10%密度传代(传至35mm平皿),继续培养24小时,待细胞密度增至20%~25%汇合时;
去掉培养液,PBS洗一次,加入按最佳筛选浓度(杀伤曲线实验确定)配制好的嘌呤霉素筛选培养基2-3ml。
根据培养基的颜色和细胞的存活情况,每隔2天更换一次筛选培养基(培养基用量为2-4ml,细胞多,多加培养基,细胞少,少加培养基), 一般在3-4天内出现细胞大量或少量死亡情况(如果转染效率或电转效率高,则死亡少;如果转染效率或电转效率低,则死亡多;如果筛选浓度偏低,筛选培养基用量少,细胞密度大于80%,会导致大量假阳性克隆)。如果筛选第一周,出现细胞大量死亡,则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周;如果筛选第一周,出现细胞少量死亡,则把细胞按10%密度传代(传至35mm平皿,传一个皿即可,多余细胞丢弃
),利用筛选培养基进行筛选一周;
筛选第二周结束后