文档介绍：实验四:免疫共沉淀—蛋白质免疫印迹分析
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【实验目的】
掌握蛋白质免疫印迹分析的基本原理
掌握蛋白质免疫印迹分析的基本操作过程
【实验原理】
蛋白质免疫印迹分析又称Western Blot,是以某种抗体作为探针,使之与附着在固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原部位发生特异性反应,从而对复杂混合物中的某些特定蛋白质进行鉴别和定量。这一技术讲蛋白质凝胶电泳分辨率高与固相免疫测定特异性强的特点结合起来,是一种重要的蛋白质分析测试手段。
蛋白质凝胶电泳利用不连续系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的分辨率。由于其电泳体系中有三种物理效应:(1)凝胶的分子筛效应;(2)电泳分离的电荷效应(3)样品的浓缩效应。
固相免疫测定是通过电场作用把凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上,封闭非特异位点后,使用目的蛋白的特异抗体检测,并通过种属特异的二级抗体的结合及放射自显影或者原位酶反应,确定抗原-抗体-抗抗体复合物的位置及丰度。
本实验是蛋白质免疫共沉淀实验的第二部分,A与p21相互作用进行检测。同时,进一步学习蛋白质免疫印迹分析原理及基本操作过程。
【实验流程】
1、配制Tris-SDS-PAGE:a洗板及电泳装置,并确定其底端的密闭性;b配置10%分离胶,~1cm,加水封闭,聚合约30min;c去水,并配置5%浓缩胶,插入梳子,注意避免气泡,室温约30min;d装好电泳装置,内槽倒满电泳缓冲液,拔去梳子,并冲洗加样孔。
2、准备样品:加入工作液为1×的loading buffer,煮沸5min,瞬离,上样。
3、电泳:80V,30min;100V, 1h。
4、转膜:湿转方式,安放顺序:黑胶(SDS-PAGE)白膜(NC膜),由阳极向阴极依次安放:3层滤纸3张,NC膜,凝胶,3层滤纸;注意除气;电转100V,1h;
5、封闭:5%脱脂奶粉封闭NC膜,室温,1h;
6、一抗孵育:NC膜放入杂交袋,封好三面,加入一抗(1:A抗体),封严杂交袋,4℃ overnight。
7、漂洗:TBST漂洗三次,每次5min。
8、二抗孵育:NC膜放入杂交袋中,加入二抗(1:2000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG),封严杂交袋,于室温1h。
9、漂洗:TBST漂洗三次,每次5min。
10、显影:将ECL化学发光试剂A液B液混合,加在有NC膜面上,反应约1 min,置荧光图像分析系统检测。
【实验结果】
Input
IgG
CoIP
marker
43KD
34KD
上图所示为Western Blot曝光图,Input即阳性对照,IgG代表阴性对照,Co-IP代表ProteinA拉下的免疫复合物,为待测蛋白,A蛋白出现在35kD大小处。
【实验讨论】
1、图中在55kD和25kD处的条带为小鼠抗大鼠P21抗体的重链和轻链。
2、由于阳性对照和免疫复合物(Co)均出现目的蛋白,说明最有可能的原因是一抗孵育的操作失误,或者