文档介绍：华中科技大学硕士学位论文
材料与方法
1. 材料
药物与试剂
主要药物
雷公藤多苷(上海复旦复华药业有限公司):以少量二***亚砜(DMSO)溶解
后,用生理盐水配成所需浓度,微孔滤膜(µm)除菌待用;
主要试剂
RPMI-1640 培养基(Gibco)、小牛血清(武汉大风生物公司)、脂多糖(Sigma)、
噻唑蓝(Duchefa)、二***亚砜(Amresco)、锥虫蓝(武汉政翔化学试剂研究所)、
TritonX-100 细胞裂解液(武汉凌飞化学试剂研究所)、IL-6 检测试剂盒(深圳晶美生
物公司),其它生化试剂均为国产分析纯(AR)级。
需要配制的试剂均用生理盐水配成所需浓度,微孔滤膜(µm)除菌待用。
细胞株
U937 细胞株-人组织细胞淋巴瘤细胞株(上海午立生物技术有限公司)、L929 细
胞株-小鼠成纤维细胞瘤细胞株(同济医学院分子免疫学系)。
细胞常规培养于 37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱内,培养液为含 10%灭活小牛血
清(Fetal calf serum,FCS)、2mmol/L 谷氨酰***、100U/ml 青霉素、100U/ml 链霉素的
RPMI-1640 培养液和 DMEM 培养液。
实验动物
清洁级昆明种小鼠,8~12 周龄,体重 22~25g(购自同济医学院实验动物中心)。
主要仪器
CO2 细胞培养箱(Forma Scientific);
低速离心机 LD4-2 型(北京医用离心机厂);
恒温水浴箱、低温高速离心机(武汉科学仪器厂);
电热压力蒸汽消毒器 YXQ-SG41-280 型(上海医用核子仪器厂);
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医用净化超净工作台 YJ-1450 型(苏州净化设备公司);
分光光度计(日本岛津);
-70℃低温冰箱(德国 Nuaire);
-20℃冰箱(日本三洋);
微型旋涡混合仪 WH-2 型(步海泸西分析仪器厂);
微量振荡器 ZW-A 型(深圳 Bio-Tek 科学仪器厂);
磁力加热搅拌器 79-1 型(深圳 Bio-Tek 科学仪器厂);
分析天平(上海科学仪器厂);
普通光学显微镜(日本 OLYMPUS TOKYO);
倒置相差显微镜(日本 OLYMPUS TOKYO);
液氮罐(云南冷冻仪器设备厂);
酶标仪 ELX800 型(深圳 Bio-Tek 科学仪器厂);
2. 方法
细胞复苏、培养及冻存[5]
细胞复苏
从液氮罐中提取出冻存细胞迅速放入 37℃水浴箱中,摇动冻存管使之在 1min 内
解冻;在超净工作台内用 70%酒精棉球擦拭冻存管外周,旋开管盖,将细胞悬液转至
已加好预温的无血清培养基的无菌离心管中,洗涤细胞;800rpm 低速离心 5min,弃
去上清,重复洗涤一次,沉淀的细胞用含有 10%~20%FCS 的完全培养基重悬后,转
入无菌培养瓶中,加入适量完全培养基,37℃、5%CO2 培养箱中培养,次日更换一次
培养液。
在 37℃,5%CO2 培养箱中,以含有 FCS 的 DMEM 完全培养基培养贴壁细
胞,含有 FCS 的 RPMI-1640 培养液悬浮细胞。根据细胞的种类和状态选择合适的血
清浓度,一般在 10%~20%之间。随时观察细胞的状态和数量,及时换液和传代。待
细胞进入对数生长期后,用于实验。
细胞冻存
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待细胞增殖进入对数生长期时,在冻存前 24h 进行换液;贴壁细胞需利用 %
的胰酶溶液解黏附,继而用无菌玻璃吸管轻轻吹打使细胞悬浮,离心收集细胞,用含
5~10% DMSO,20%~50%血清的完全培养基重悬并调整细胞浓度为 5×106/ml,按每管
1ml 的体积分装入冻存管,置 4℃下 30min,-80℃下 1h,最后移至液氮中保存。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离、纯化和培养[4,5]
于小鼠腹腔内注射 4ml 磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline,PBS),轻揉其腹部
使液体充分流动,5min 后处死小鼠,75%乙醇消毒其腹部,收集腹腔液于无菌离心管,
1500rpm 离心 10min 收集细胞,用 10%FCS RPMI-1640 培养液悬浮细胞,调整细胞浓
度为 1×106/ml,置于 96 孔培养板中,每孔加入 100µl 细胞悬液。37℃、5% CO2 培养
4h,弃上清,PBS 洗去未黏附细胞,即为所需 MФ。
每孔加入终浓度为 10µg/ml 的 LPS 以激活 MФ,同时加入 50µl 不同剂量的 TW