文档介绍：实验七、细胞器的分离与观察
『目的要求』
1、掌握细胞器分离的原理(细胞核与线粒体)
2、掌握离心分离细胞器的一般操作程序
『实验用品』
普通离心机、冷冻高速离心机、8ml离心管、匀浆器、eppendorf管、光学显微镜、解剖工具、纱布、载玻片、冰块、生理盐水、(匀浆介质)、(离心介质)、固定液(甲醇-冰醋酸=3:1)、Giemsa染液、 Janus green B、小鼠
『实验原理』
利用各种物理方法如研磨、超声振荡和低渗等将组织制成匀浆,细胞中的各种亚组分即可从细胞中释放出来。由于细胞内各种颗粒成分的大小、形状和密度不同,可以利用不同的离心方法进行分离,通过组织匀浆、分级分离和分析三步完成。
分离的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。
差速离心法:由低速到高速逐级沉淀分离,使较大的颗粒先在较低转速中沉淀,再用较高转速将原先悬浮于上清液中的较小颗粒分离沉淀下来,从而使各种亚细胞组分得以分离,必须反复悬浮和离心加以纯化。
差速离心法逐级分离出各个细胞器
大颗粒中颗粒小颗粒
低速离心
中速离心
高速离心
超速离心
不同大小的生物颗粒可以利用不同的离心机分离:普通离心机(8000r/min)可分离直径大于1µm的生物颗粒;高速离心机(8000-25000r/min)-10µm的生物颗粒;超速离心机(25000-80000 r/min)-100nm的生物颗粒和生物大分子。为了限制和保持细胞亚组分内酶的生物活性,有的离心机还装有低温控制装置(0-4℃)。
离心场的离心力常用重力加速度g( m/s2)的倍数来表示,而实际操作时人们****惯用r/min(离心机转子每分钟旋转的圆周数)来掌握。两者关系如下:
离心力g=×10-5n2r
注:r为离心机中轴到离心机远端的距离,n为离心机每分钟的转速(r/min)
『实验内容和方法』
1、低速分离细胞核
(1) 将小鼠杀死,取出肝脏,剪成数小块,用预冷的生理盐水反复洗涤除去血污,用滤纸吸干表面的水分。
(2)称取肝组织1g,取8ml预冷的匀浆介质,先加入少量于小烧杯中,尽量剪碎肝组织,再将剩余的预冷匀浆介质加入其中。
(3)匀浆,用3-4层纱布(先用少量匀浆介质润湿)过滤匀浆介质至离心管中(可先过滤至皿中),离心管内匀浆液为6-8ml。
(4)普通离心机里以2500r/min的速度离心15分钟,缓缓吸取上清液,移入eppendorf管中,放在有冰块的器皿中,等分离线粒体时用(直接进入第二大步)。同时制一张上清液涂片A,做好记号,自然干燥。
(5)用8ml离心介质悬浮沉淀物,用吸管混匀,以2500r/min的