文档介绍：实验七、细胞器的分离与观察『目的要求』1、掌握细胞器分离的原理(细胞核与线粒体)2、掌握离心分离细胞器的一般操作程序『实验用品』普通离心机、冷冻高速离心机、8ml离心管、匀浆器、eppendorf管、光学显微镜、解剖工具、纱布、载玻片、冰块、生理盐水、(匀浆介质)、(离心介质)、固定液(甲醇-冰醋酸=3:1)、Giemsa染液、JanusgreenB、小鼠『实验原理』利用各种物理方法如研磨、超声振荡和低渗等将组织制成匀浆,细胞中的各种亚组分即可从细胞中释放出来。由于细胞内各种颗粒成分的大小、形状和密度不同,可以利用不同的离心方法进行分离,通过组织匀浆、分级分离和分析三步完成。分离的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。差速离心法:由低速到高速逐级沉淀分离,使较大的颗粒先在较低转速中沉淀,再用较高转速将原先悬浮于上清液中的较小颗粒分离沉淀下来,从而使各种亚细胞组分得以分离,必须反复悬浮和离心加以纯化。差速离心法逐级分离出各个细胞器大颗粒中颗粒小颗粒低速离心中速离心高速离心超速离心不同大小的生物颗粒可以利用不同的离心机分离:普通离心机(8000r/min)可分离直径大于1µm的生物颗粒;高速离心机(8000-25000r/min)-10µm的生物颗粒;超速离心机(25000-80000r/min)-100nm的生物颗粒和生物大分子。为了限制和保持细胞亚组分内酶的生物活性,有的离心机还装有低温控制装置(0-4℃)。离心场的离心力常用重力加速度g()的倍数来表示,而实际操作时人们****惯用r/min(离心机转子每分钟旋转的圆周数)来掌握。两者关系如下:离心力g=×10-5n2r注:r为离心机中轴到离心机远端的距离,n为离心机每分钟的转速(r/min)『实验内容和方法』1、低速分离细胞核(1)将小鼠杀死,取出肝脏,剪成数小块,用预冷的生理盐水反复洗涤除去血污,用滤纸吸干表面的水分。(2)称取肝组织1g,取8ml预冷的匀浆介质,先加入少量于小烧杯中,尽量剪碎肝组织,再将剩余的预冷匀浆介质加入其中。(3)匀浆,用3-4层纱布(先用少量匀浆介质润湿)过滤匀浆介质至离心管中(可先过滤至皿中),离心管内匀浆液为6-8ml。(4)普通离心机里以2500r/min的速度离心15分钟,缓缓吸取上清液,移入eppendorf管中,放在有冰块的器皿中,等分离线粒体时用(直接进入第二大步)。同时制一张上清液涂片A,做好记号,自然干燥。(5)用8ml离心介质悬浮沉淀物,用吸管混匀,以2500r/min的速度离心