文档介绍：Transbody-侵袭
细胞被干预后(药物处理、转染、电转、感染)适当时间点(考虑上述处理因素起作用的时间,Transbody检测时间窗口为16-24小时),作活细胞计数(台盼蓝染色),把适量活细胞(1-3万个)接种至Transbody中,注意细胞接种一定要均匀,如果是药物处理,要考虑是否继续加药处理,如果是转染,电转,感染,不再进行第二次处理;
配制包被缓冲液: Tris (pH ), % NaCl,;Matrigel在4°C下冻融过夜,溶解后充分摇匀,然后立即放在冰上,一旦升温,容易凝固;包被缓冲液在4°C预冷至少2h,枪头和EP管在-20°C下提前预冷过夜;
用包被缓冲液把Matrigel稀释为200-300 μg/ml,需要多少稀释多少(可以多稀释100ul),快速混匀,立即放在冰上;每个transwell孔加入100ul,要保证孔底与Matrigel充分接触,避免Matrigel与孔壁接触;避免产生气泡,如果有气泡,可300 x g, 10 minutes ,4°C离心;包被过夜后,吸走剩余的液体,用培养基润洗1-2遍;上室加入细胞(100 ul 无血清培养基,1-3万),下室加入完全培养基600ul;37度 5%CO2培养24小时;
用棉签擦去上室内的细胞,用PBS把上室内的细胞残留;结晶紫染色10min,洗涤残留的染液;把膜剪下,晾干后,用中性树脂封闭于载玻片,拍照,随机拍至少6个视野,用软件对图片进行细胞计数,然后对数据进行统计分析;
注意事项:
1. 选择合适直径(Transwell的大小,,为24孔格式,上述实验适用的是常用格式)和孔径(膜的孔径,(用于细胞间接共培养), 4um(用于血细胞分析), 8um(用于肿瘤细胞和其他组织细胞分析))的Transwell,Transwell被Matrigel包被后称为Transbody