文档介绍：DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ
采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记,碱性标记,利用CSPD化学发光检测,随时即用。
货号:11 585 614 910
此试剂盒储存条件:-15℃到-25℃。
此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行12次标记反应,
可检测10×10cm2面积的杂交膜24张。
指导手册
版
1 前言
内容表
1 前言
内容表
试剂盒成分
产品简介
3. 操作步骤和所需材料
在你开始前
流程图
地高辛标记DNA
标记效率的确定
DNA的转移和固定
杂交
免疫检测
DNA印记的洗脱和再杂交
4. 附录
故障排除
参考文献
订购信息
试剂盒的成分
瓶号
标记
内容
包括功能
1
DIG-高效引物
50μL 地高辛标记的高效引物
5×浓度的标记混合物:优化的浓度的随机引物,核苷酸,地高辛标记的dUTP(碱标记的),Klenow酶和缓冲液成分
随时可用
澄清的粘液
用于DNA的高效随机引物标记
2
DIG标记的对照DNA
20μL
5μg/mL 质粒pBR328 DNA (用Bam HI线性化)
澄清溶液
用于确定标记效率
3
DNA稀释缓冲液
3管1mL
50μg/mL鱼精DNA,10mM Tris-HCl,1mM EDTA, 在25℃
澄清溶液
4
抗地高辛的碱性磷酸酶结合物
50μL
750U/mL
从羊中获取的,Fab段,结合碱性磷酸酶
澄清溶液
5
CSPD
随时可用
50mL CSPD
澄清溶液
6
封闭液
4×100mL
10×浓度
黄色,粘液
7
地高辛杂交颗粒
100mL地高辛杂交液共4瓶,用于DNA杂交
附加仪器与所需试剂
除了上表中列出的试剂外,你必须准备一些溶液。在下表中,你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。
在每个操作程序的前面提供了详细的信息。
操作程序
仪器设备
试剂
DIG-DNA标记
水浴
灭菌的双蒸水
灭菌的EDTA
标记效率的半定量
带正电荷的尼龙膜*
地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者
洗涤缓冲液
马来酸缓冲液
检测缓冲液
DNA转移和固定
紫外光盒
或者商业化可用于紫外交联的其他设备
20×SSC
或者10×SSC
杂交
尼龙膜,带正电荷*
杂交袋*,
或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶
注意:当用地高辛杂交缓冲液工作时,不要用开口的托盘。
免疫检测
耐热的塑料袋或者滚筒瓶
杂交袋*
地高辛洗涤和封阻缓冲液组合*,或者
洗涤缓冲液
马来酸缓冲液
检测缓冲液
DNA 斑点的脱色和重新标记探针
大的托盘
水浴
10×SSC
10%SDS
NaOH
*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得。
产品概况
实验原则
此试剂盒采用DIG(地高辛),一种甾类半抗原,steroid hapten去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测[1,2,3]。
步骤
描述
DNA 标记
根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标记的DNA探针。地高辛标记的高效引物是一种专门生产的反应混合物,其中含有地高辛dUTP,碱性标记(图1)和所有的试剂,包括随机引物标记所必须的酶,已预先混合优化的5×浓度反应缓冲液。
杂交
根据标准方法,地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP能够更加容易和有效的被洗脱下来,使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交。
免疫检测
杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测,Fab段,然后采用即时可用的化学发光底物CSPD可以看到杂交结果。采用碱性磷酸酶可以对CSPD进行,酶的脱磷酸化,导致在最大波长477nm处有光的发射(图2),这一现象可以用适合的图像仪或者X光片进行记录。胶片的曝光时间范围只在5-30分钟内。
图1 DIG-dUTP ,碱性标记图2 CSPD反应
应用地高辛标记DNA探针可以用于:
所有类型的滤膜杂交
总基因组DNA中单拷贝基因的检测,甚至对于高度复杂的生物体也可以进行检测,如人,大麦和小麦。
样品材料
至少100bp的DNA片段
线性的质粒,cos质粒或者DNA
超螺旋的DNA