文档介绍：植物DNA的提取与纯化 DNA extraction
实验一
实验原理
植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。对DNA提取一般有三个要求:
1. DNA的纯度可以满足下游操作的要求
2. DNA必须完整
3. DNA应当有足够的量
一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。
如果对植物进行大规模筛选,操作程序应当快捷,简便,价格低廉,并尽可能避免使用有毒试剂。
脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)
与蛋白质结合在一起以核蛋白(DNP)的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。
植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内,后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内,例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。
核酸的存在形式
核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶,DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、***仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时,先把DNP抽提出来,再把蛋白质和糖去除,同时除去RNA及无机离子等,从中分离DNA 。
提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法,对它们进行稍加修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。
具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、***仿抽提的方法去除蛋白,得到的DNA溶液经乙醇沉淀。
①机械方法: 超声波处理法、研磨法、匀浆法;
②化学试剂法:用SDS处理细胞;
③酶解法: 加入溶菌酶或蜗牛酶,破坏细胞壁。
细胞破碎
SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。
CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂,它可以溶解膜与脂膜,使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来,并使蛋白质变性,使DNA与蛋白质分离。
DNA提取
实验材料和试剂
实验材料:新鲜植物组织。
100 mmol/L Tris-HCl ()
50mmol/L EDTA
500 mmol/L NaCl
% SDS
DNA提取缓冲液
实验所需试剂:
24:1/***仿:戊醇
其它试剂:液氮、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇。
2×CTAB buffer
100mM Tris
NaCl
20 mM EDTA
2% CTAB
% 巯基乙醇
酚/***仿(1:1)
***仿:50 ml
无水乙醇
蛋白质常用苯酚:***仿:异戊醇(25:24:1)或***仿:异戊醇(24:1)抽提。
RNA 常选用RNase消化,或是用LiCl来消除大分子的RNA。
酚类物质提取液中加少量巯基乙醇,选取幼嫩的材料。
多糖提取液中加1%PVP。
DNA纯化(去杂质)