文档介绍：上海第二医科大学
硕士学位论文
基因重组表达心肌肌钙蛋白T、I
姓名:高丰厚
申请学位级别:硕士
专业:临床检验诊断学
指导教师:郑佐娅
20040501
标。起先使用的血清标志物是肌酸激酶和心脏特异性的肌酸激酶同工酶幼庞钟酶恿槊舻募『斓鞍鬃魑T缙谛募∷鹕酥副辍W罱募价偶联成复合物:肌钙蛋白复合物定位于原肌球蛋白中。隩在心肌和骨骼肌之间氨基酸序列之间存多为肌钙蛋白复合物形式。分子生物学的进展,使人们通过基因重组的方法大量例为%。对这些稀有密码子的分析表明,存在两对连续的使其在瓹械谋泶锼浇系偷闹饕T颉Mü杓魄〉钡囊镆约袄,在此基础上构建了./、、谋泶镏柿#;隑,基因重组表达心肌肌钙蛋白急性心肌梗死早期的心电图变化既不特异也不敏感,临床上已渐渐依靠心肌组织损伤的生化标志物作为早期诊断的指肌钙蛋白的亚单位由于具有高度的特异性,已经成为推荐的心肌损伤的标志物。肌钙蛋白存在于心肌和骨骼肌中,由三个亚单位以非共可结合钙离子;肌钙蛋白是抑制亚单位:肌钙蛋白ḿ「频鞍在差异,因此可通过建立免疫测定方法检测心肌型与。建立免疫测定方法,获得高纯度抗原是首要的和必须的问题。以往国内外获取与蛋白多采用从心肌提取的方法,这些方法较为繁琐,且得到的大获取目的蛋白成为可能。近年来,国内外有人尝试用基因重组的方法表达与,但存在一些问题诸如表达量偏低,的稳定性不够高。本文拟通过同义替换基因上的稀有密码子,选取蛋白的稳定区段对应的基因,在瓹斜泶锵嘤Φ娜诤系鞍祝鄄炱浔泶锪俊⒚庖呋钚约捌湮榷ㄐ浴第一部分。成人心肌肌钙蛋白幕蛴个密码子,对甤此涤个编码精氨酸的稀有密码子,其中有个个苈胱樱急,推测『怯捎赾蛑械恼饬蕉訟玞械腁婊怀蒀,分别得到中文摘要诱导表达,结果表明上海第二医科大学硕畚、、、
甘肽R泼的融合蛋白,即诤系鞍祝ü入赘孰囊磺碇糖亲和层析纯化融合蛋白。,使其在大肠杆菌中表达娜诤系鞍住J笛榻峁允我们正确获得了融合蛋白—。通过谷胱甘肽一琼脂糖亲和层析的稳定性优于天然提纯的乖其稳定性。本文对与所作的诤媳泶锏难芯浚壳肮谕馍形见报道。。这些研究为建立相应的免疫测定提供了坚实的物质基础。关键词:重组蛋白,肌钙蛋白「频鞍譏,免疫活性,稳定性一./、泶锏哪康牡鞍赘哂贐甈疶,而一一/泶锏牡鞍琢孔疃唷U庹缤撇獾哪茄玊中连续的两对蓖逄婊怀蒀,结果就高效表达鞍住1泶锕入与电化学发光测定法,结果都表第二部分,不同的分子片段有不同的稳定性,┝艘惶跸咚鳎ü因重组表达的第—话被幔怯形南妆ǖ澜鼋鲋刈楸泶锔闷危稳定性提高并不明显。考虑到融合蛋白不仅能增加目的蛋白的稳定性,而且有利于表达后的提纯,,与表达白和相应的抗体相互作用,且鞍撞挥胂嘤Φ目固遄饔谩2捎肊法对所表达的融合蛋白的免疫稳定性作初步的探讨,结果表明—总之,基因上的两对稀有密码子的同义替换,可提高其在瓹械明表达的融合蛋白和相应的抗体相互作用,且鞍撞挥胂嘤Φ目固遄饔谩纯化融合蛋白,与化学发光测定法,结果都表明表达的融合蛋表达量:选取耐受蛋白酶降解的基因区段,作诤系鞍妆泶铮筛纳上海第二医科人学硕士论文
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第一部分成人心脏肌钙蛋白脑吮泶铩⒌鞍状炕懊庖呋钚缘某醪教教急性心肌梗死欠⒉÷屎退劳雎式细叩募膊≈弧T谥疃嗾锒螦的指标中,肌酸激酶及其同工酶甅曾一度被认为是诊断的“金标准”而广泛应用多年。随着对心肌损伤标志物的不断深入研究,逐渐发现若干灵敏性、特异性更好的标志物。其中,心肌肌钙蛋白云溆乓斓牧槊粜和特异性正逐步取代.,成为判断心肌损伤的确定标志物‘肌钙蛋白由三个亚单位组成:肌钙蛋白、肌钙蛋白图「频鞍譚H鲅堑ノ唤岷喜⑶矣爰∏虻鞍滓黄鸸钩蒚甌复合体,调节肌肉收缩和舒张的力量和速度。诠趋兰『托募≈校被嵝列是完全相同,因此心肌肌钙蛋白荒茏魑P脑嗵匾煨员曛疚铩3扇说腡和谛募『凸趋兰〉陌被嵝蛄惺怯星鸬摹1嗦胄募的基因只在胚胎期骨骼肌中有短暂表达,成人后,肌钙蛋白墓趋兰⌒秃托募⌒驮诮峁股有很大的区别,它们与相应抗血清的交叉反应仅为%,所以心肌型肌钙蛋白勺魑P募∷鹕说奶匾煨员曛疚飂是原肌球蛋白结合亚基,基因位于染色体上。在人的心脏中至少有四种亚型的:由全部的个外显子组成;缺失第四个外显子:缺失第五个外显子;缺失四和五外显子,见下图。心脏发育的不同阶段和某些病理情况下,表达不同的亚型。正常成人表达亚型,该亚型的编码区有嗦个氨基酸,分予量’“。上海第二医科火学