文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
利用HSV-tk研制肝脏特异损伤的转基因小鼠模型研究
姓名:张艳
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:曾溢滔
20040901
利用研制肝脏特异损伤的转基因小鼠模型的研究水平分析比较载体的转蒙活性或杀伤能力,选择出了细胞水平活性较高的载体进行因动物技术在人类肝脏疾病模型建立中起熏要的作用。但是,用传统的转基因方法制备动物疾病模型时在实验上难以控制,在动物的特定组织表达蛋白毒素时,动物常会在早期死亡。单纯疱疹病毒胸瞢嘧啶激酶哂懈袈逦珿舾行裕挥τ迷谔匾煨韵赴贸攵物疾病模型制作,靶向性地损伤可以通过组织特异性启动子的驱动而获得。白蛋白,基因启动予由于保守性与高度的肝脏特异性表达使之成为合适的调控元件被应用在转基因技术中。本研究首先克隆了小鼠血清白蛋白基因启动子转基因小鼠雄原核显微注射,获得了目的基因整合与特异表达的转基因小鼠品系。进一步通过尾静脉注射盏甲;蛐∈蟾卧嗨鹕耍运穆然,损伤小鼠必对照观察疾瘸韵进程。通过血液的生化检查,肝脏与肾脏等组织的病理形态学分析来研究转基因小鼠的损伤效应。本研究为肝病转基因动物模型的建立,为探讨肝病的发病机制、病理生理过程、病理形态改变及药物防治等研究开拓了广阔的前景。本研究主要分为三个部分。小鼠与的克隆与功能研究中文摘要肝脏疾病是人类最常见的疾病之一,严重威胁人类健康。肝病动物模型可以模拟某些不能直接在人类身上进行观察与研究的疾病,是医学研究的重要手段。转基增强子,菇耸芷涞骺氐种表达载体,然后在细胞通过参阅文献,将查阅到的小鼠血清白蛋自基因调控元件功能区与,一卜海第一医科人学博谎宦畚,
竦玫暮琄序列的与不含该序列的构建载体含与B妓俾屎妥橹匾煨韵喙氐难粜杂胍跣宰饔们颉1臼笛榭寺〉腅龉δ芮,,渖细缓卧嗵匾斓区为正向调控区;区为负向调控区。经测序证实启动子序列与ú嫉男蛄幸恢拢銮孔拥男蛄写嬖诹礁鐾槐湮点,均不在功能区。在得到与序列后,实验采用瞬时转染对其转录活性进行分析。选择1ǖ阑颍菇巳衷靥琾琾,其中的调控元件分别:与位于报道基因下游的。转染人肝癌细胞瓽具有分泌δ和非肝脏细胞.∈笕橄偕掀は赴。%,,ァ说嘎三种载体具有肝脏细胞表达特异性,在瓽邪性媳泶锼轿廾飨圆钜欤但与位于上游的作为调控元件在细胞水平的活性稍高。小鼠/驱动载体表达的研究件驱动目的基因的表达。为了在翻译水平进一步提高表达,引进了通过小鼠基因组序列进行同源比较,从而确定我们需要克隆的区域。利用巢式┰═蚝妥B计鹗嘉坏慵捌渖嫌蔚鹘谇颍嫌蔚鹘谇点上游罨合龅鞍捉岷衔坏悖渖峡山岷细卧嘞赴缓囊蜃雍屯ㄓ转录因子:肝核因子珻/,白蛋白坏憬岷系鞍,,核因子琋艘蜃覻,.。,包转录因子结合位点猅珻/.。区包含两个肝脏特异的岷系鞍駼位点;为:仅有而无;篜胛挥赑嫌蔚腅在上述研究的基础上,本研究选择与位于上游的作为调控元,利用可信度极高的聚合酶扩增序列。琀一,銮孔咏岷系鞍珼胃患B技せ畹鞍~二~/—汉5谝灰娇拼笱Р﹍:学位论文
转基因小鼠的产生与盏妓鹕说难芯回收的蜭讲酱炕⒂眯墼讼晕⒆⑸浼际趸竦昧搜性转基因小鼠,琒産縋检测转基因的整合,结果表明获得縋对转基因的拷贝数进行精确定量,可知疜,琓,,以及的后代小鼠均为多拷贝熏复,且拷贝数在各家系不相同,但同一家系转基因的拷贝数是相同的。缂蚁敌∈,结果表明:辉鶷琓,琣∈笸庠椿蛘戏绞娇赡芤晕6嗫奖基因传代。。原代与子代雄性转基因出小鼠均为雄性不育。丸外其它组织与器官均没检测到的转录,说明谋泶锞哂辛己玫淖化学分析,发现在部分肝实质细胞内表达,表达细胞占总肝细胞的~%;,分别转染细胞瓽際珿处理基因旌螅募谆嫉技术分析细胞的存活率。结果表明,。实验证明本研究构建的载体具有较高的杀伤效应以及细胞特异性,从而为转基因小鼠的研制提供了依据。≡裰刈樵靥錺,用限制性内切酶蚐盖兄刈樵靥澹了辉;蛐∈骉琓,琓,,;小鼠的拷贝数最低为头尾串联连接为主。ü胍吧∈蠼慌洌;蛐∈骉早能够以%阳性比例进行转分析毋与小鼠搬的转录,除肝脏与睾织特异性。肏雇枚嗫寺】固宥訲..小鼠肝脏切片进行免疫组织雄性不育首建者敌∈驢泶锵赴甲芨蜗赴ァ细胞有更高的杀伤效应ヌ岣叩,两质粒对—细胞均没有杀伤作三唑蓝一,..琈/上海第二匡科大学博十学位论史
Q芯縂诱导损伤后病理生理变化,采用相同年龄的的转基因小鼠小鼠悖源菩訲早为首建者的小鼠代挥隖只。小鼠组尴灾圆钜欤得鱰晷∈笤贕处理后肾脏功能的正常。病理形态学普遍表现为点状或灶性坏死,炎性细胞浸润,有凋亡细胞存在,肝细胞以上结果表明所有