文档介绍：实验三、小鼠精子畸形试验
一、目的
精子畸形试验是检测受试化学毒物能否破坏哺乳动物精子正常形态的实验方法。通过该实验,学****和掌握小鼠精子畸形试验的原理和步骤。
二、原理
精子畸形是指精子的形状异常和异常精子数量的增多。生殖系统对化学毒物的作用十分敏感,在其他系统还未出现毒性反应前,生殖系统可能已出现了损害作用。正常情况下,哺乳动物的精液中也存在少量的畸形精子,但在某些化学毒物的作用下,特别是在可引起生殖细胞遗传性损伤的化学毒物作用下,哺乳动物睾丸产生的畸形精子数量可大量增加。因此,可以用检查雄性动物接触化学毒物后精子畸形率的高低,来反映该化学毒物的生殖毒性和对生殖细胞潜在的致突变性。
化学毒物引起精子畸形的机制尚未完全清楚。正常情况下,精子的成熟和正常形态发生过程受多种基因调控,一旦这些基因中的一个或多个在化学毒物的作用下发生突变,就会导致畸形精子数量的大量增加。一般认为,常染色体上的基因控制精子畸形,Y-性连锁基因控制畸形精子的表现。某些特异的染色体重排,如性、常染色体易位,是化学毒物诱发哺乳动物精子畸形率增高的主要机制。
三、器材和试剂
(一)器材
眼科剪、眼科镊、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、带橡皮头吸管。
{二}试剂
磷酸盐缓冲液(称取NaCl 8g、KCl 、KH2P04 、,用蒸馏水溶解并定容至1000mml)、生理盐水、甲醇(分析纯)、***磺酸甲酯或***磺酸乙酯或环磷酰***、2%伊红水溶液。
四、操作步骤
(一)、动物选择
成熟大鼠、小鼠均可使用。一般采用雄性小鼠,年龄宜在6—8周。因小鼠较为经济,且有大量实验证实小鼠在该试验系统中对化学毒物最为敏感。
(二)、剂量与分组
试验至少应设3个以上剂量级,并同时设立阳性对照组和阴性对照组。接触化学毒物后每组至少应存活5只动物。最高剂量组5d总剂量应能使部分动物死亡。
一般可采用LD50的2~4倍剂量,或预先做5d给予化学毒物的LD50,求得最高总剂量,然后以它的1/2(或1/5、1/10)作为下一剂量组的接触剂量,依此类推。
阳性对照可用环磷酰***20mg/kg或***磺酸甲酯75mg/kg或***磺酸乙酯60mg/kg进行腹腔注射,每天1次,连续5d。阴性对照选用与受试化学毒物相同体积的溶剂。
对于不稳定或稳定性不详的受试化学毒物,应每天新鲜配制。
(三)、染毒与采样
可采用1次或每天1次连续5d的方法进行染毒。染毒途径多用腹腔注射,也可采用与人体实际接触化学毒物相同的途径,如经口、吸人和皮肤接触等。
一般认为精原细胞后期或初级精母细胞早期对化学诱变剂较为敏感,在接触化学毒物后4—5周精子畸形率最高,故选择在第一次染毒后第35d进行采样。也可在染毒后第1、第4和第10周分3次采样,或者在染毒后每周采样1次,连续进行动态观察,直至精子形态恢复正常。
(四)、制片
用颈椎脱臼法处死小鼠,剪开腹腔,分离并摘取双侧附睾,将附睾放入盛有约lml磷酸盐缓冲液或生理盐水的小平皿中,以眼科剪将附睾剪成小块,用吸管将悬浮液轻轻吹打5—6次,静置3—5min,用4层擦镜纸过滤除组织碎片,吸取此精子悬液滴于清洁载玻片上,均匀推片,。也可用2%的伊红水溶