文档介绍：上海第二医科大学
硕士学位论文
人巨细胞病毒抗原性肽段的固相合成及以其为抗原的ELISA检测
方法的建立
姓名:孙立山
申请学位级别:硕士
专业:临床检验诊断学(免疫学测定)
指导教师:周文达
20050401
日期:洌㈢.作者签名;圣郝⒌闻臭连学位论文作者签名:引、盍山学位论文使用授权声明学位论文独创性声明日期:丝竺、竺,日期:至翌￡:生:印本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中作了明确说明并表示谢意。本人完全了解上海第二医科大学有关保留、使用学位论文的规定,学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查导师签名:/
人巨细胞病毒抗原性肽段的固相合成及以其为抗原的觳夥椒ǖ慕内感染或围生期感染,可致感染患儿中枢神经系统受累、多器官损害、智力低下或耳聋等;在正常健康人中可引起单核细胞增多症;在免疫状态低下的人群官移植受者、艾滋病患者、癌症患者及放射损伤患者等校琀梢鹧重的感染,甚或致死。鉴于在临床疾病中的重要作用,已经引起医学界巨细胞病毒感染的实验室检测有多种方法,除了病毒的分离,还包括抗体检测、抗原检测、病毒核酸检测、等方法。传统的人巨细胞病毒特异性抗体的检测多是以病毒裂解物为抗原,此类抗原存在很多缺点:①由很多病毒抗原组成,所含抗原表位不确定,很难标准化:②需要在成纤维细胞中进行病毒培养,会导致潜在细胞蛋白的污染。由于器官移植受者可能会产生暂时性自身抗体反应,而细胞蛋白的污染可能会导致抗体检测结果出现假阳性;③体检测的敏感度和特异性,本研究根据强抗原性表位,拟以固相多肽合成方法合成抗原性肽段,并以此多肽为抗原建立对特异性抗体检根据国外对抗原性表位的研究,我们选择了病毒蛋白、及个强抗原性表位。以匿相多肽合成技术曲基团保护的氨基酸为原料,以/作为偶联试剂/活化剂,。然后将多肽从树脂上裂解下来,洗涤,冻干,得到粗肽。所得粗肽再经过离子交换层析和反相高效液相色谱纯化,最终得到纯度サ目乖摹实验条件。并以所合成的坞姆直鸢⒖装澹约浣覧方法,对所中文摘要人巨细胞病毒琀也称人疱疹病毒琀属逭畈《狙强啤H司尴赴《驹谌巳褐懈腥痉浅F毡椋但大多数临床上呈不显性感染或潜伏感染,多数人在儿童或青少年期受感染后获得免疫。对于孕妇,原发感染或新的复发感染可引起新生儿宫与疱疹病毒科的其它病毒感染所产生的抗体存在交叉反应。为了提高抗测的椒ā訤猈髦9滔嘣靥澹訬—狥应用棋盘滴定实验确定了抗原肽的最佳包被浓度、最佳包被用缓冲液等最适的广泛重视。
个肽段有较高的反应性,对于固寮觳个肽段具有较高的反应性。这些强抗体反应性表位的氨基酸序列与国外报道的基本一致,但我们实验中发现,蛋白一表位在我国人群中抗体反应性较高,可能是由于人群差基于对以上肽段抗体反应性的评价,我们选择抗体反应性较高的肽段,将各以各肽段直接包被及与剂P问浇邪弧=峁允荆蘼鄱訦测定还是对舛ǎ楹想闹苯影唤螧一肽偶联形式包被效果好,本底较低,可能肽偶联形式包被存在非特异性吸附,造成测定本底偏高。%,特异性均为ァS肱访墒约良觳饨峁啾龋⑽廾~%.杂贗测定..ァ.%杂赱测定⑶椅榷ū固宓募觳舛嘁览涤诩浣覧方法,但间接易受许多影响因素的干扰,而痘穹‥则可以有效的克服这些干扰。因此我们对所合成的多肽以辣根过氧化物酶斜昙牵⒍曰诤铣啥接啾让舾卸冉鲇%,可能由于多肽与呐剂T斐闪瞬糠直砦活性丧失,或者是与酶的偶联影响了表位的呈现。但捕获法测定阳性与阴性对比明显,阴性本底很低,非特异性干扰影响较小,结果容易判断。还需进一步对不同肽段的特性及肽与酶的偶联方法上做进一步的研究,以期能找到合适的不影响总之,该研究应用以一氨基酸作为原料,以/作为偶联/活化试剂的固相多肽合成技术,⑶也始按慷染玫铰獾慕峁H缓笸以这些肽段为抗原的检测特异性抗体的间接椒āN颐撬⒌合成的肽段的抗体反应性分别进行了评价,结果发现对于固寮觳异所致。肽段混合后楹想作为特异性抗体检测用抗原,包被用抗原肽分别显差异。我们所建立的间接椒ǎ诒湟旌团浔湟旆直鹞‘.ィ存鲈挛廾飨圆钜臁肽的痘穹‥做了初步尝试。结果我们所建立的捕获法与欧蒙公司问表位反应活性的偶联方法,提高检测的灵敏度。过对不同肽段