文档介绍：基本概念及原理
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段,将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA分子的含量[1][2]。
  
Southern印迹杂交显色图片
Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是:具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下,可按碱基互补的原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性,综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果,便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图,或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求,还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程:一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,即印迹(blotting);二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火,即分子杂交过程。,Southern印迹杂交故因此而得名。
  
southern印迹杂交原理流程图
早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后,经毛细管的虹吸作用,转移到硝酸纤维膜上。印迹方法如电转法、真空转移法;滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜(如APT、ABM纤维素膜)等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析(RFLP)等。
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发明人
1975年,Southern印迹杂交(Southern blot)由英国人埃德温·迈勒·萨瑟恩(Edwin Mellor Southern)创建。
  
埃德温·迈勒·萨瑟恩
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基本方法及主要步骤
以哺乳动物基因组DNA为例,介绍Southern印迹杂交的基本步骤。
一、待测核酸样品的制备
(一)制备待测DNA
基因组DNA是从动物组织(或)细胞制备。,或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞;;(酚/氯仿)抽提方法去除蛋白质。
(二) DNA限制酶消化
基因组DNA很长,需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析,通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子,但有时为了某些特殊的目的,分别用不同的限制酶消化基因组DNA。切割DNA的条件可根据不同目的设定,有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。消化DNA后,加入EDTA,
65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离,必要时可进行乙醇沉淀,浓缩DNA样品后再进行电泳分离。
二、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品
(一)基本原理
Southern印迹杂交是先将DNA样品(含不同大小的DNA