文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
Ang-1转染BMSCs复合TCP陶瓷修复兔桡骨缺损的实验研究
姓名:张晔
申请学位级别:博士
专业:外科学(骨科)
指导教师:曾炳芳
20040401
摘要创伤、感染等各种原因造成的大面积骨缺损的修复一直是临床的一个难题,组织工程方法修复为骨缺损的治疗提供了新的思路。骨组织工程修复过程与血供重建具有密切关系,可以提供种子细胞增生、生长必须的营养以及加速材料的降在血管形成理论指导下,模拟体内信号调控过程,补充必须的细胞因子,有利于创造局部血管的形成和血供重建的条件。由于直接补充细胞因子易于降解和基因引入种子细胞,可以稳定表达蛋白因子,促进局部生长。本试验目的是在血管形成理论指导下构建在血管形成信号中起发育、成熟信号调节作用的血管生成修复兔桡骨缺损,观察骨修复及血供重建,为进一步加强预构材料血供,深入骨组织工程研究打下基础。由于人类与动物的细胞属于真核细胞范畴,其基因编码的蛋白表达与调控受真核表达信号系统调节,包括启动子元件、增强子及负性调控元件等。进行的真核细胞转染实验,首先必须建立的真核表达载体。属于穿梭载体,具有蚢、筛选基因,因此可以在原核细胞及真核细胞大量扩增,在基因工程中得到广泛运用。我们选用作为,在已建立克隆人血管生成素一吮泶镌靥寤∩瞎菇ㄕ婧吮泶镌靥澹=徊焦撬栉食渲流失,基因疗法成为目前组织工程中补充细胞因子促进发育的有效方法,将目的素猯,恼婧吮泶镌靥宀⒔泄撬杓涑渲矢上赴珺奶逋庾H荆春蟃陶瓷进行体内植入解。上海第二医科大学博上学位论文
珺奶逋庾H炯案春喜牧瞎菇ㄗ织工程人工骨进行体内修复研究作基础。酶切电泳结果显示:构建载体以限制性ッ盖泻螅直鹦纬上咝云危ざ扔朐泶镏柿O嗟取而双酶切则形成和两个片段,。片段大小均符合设计,证明一一靥骞菇骨髓中易于获取,是目前首选的种子细胞,在组织工程中获得广泛应用。实验中采用密度梯度离心法分离赴鲋城呦允咎逋夥掷肱嘌腂生长旺盛,增生活跃,具有良好的细胞生物学特性。由于砻婢哂蠧,,确肿樱鳦,,等分子缺乏。因而对其进行了上述分子的流式细胞仪检测,显示鳦一徊街っ髁伺嘌赴的生物学特征。表明细胞在数量与质量上,都达到组织工程与基因工程后续实验的要求。由于间充质干细胞具有多项分化潜能,因此若不加以诱导,其会产生大量脂肪细胞等混杂细胞,从而延缓其骨修复作用。地塞米松癿/、维生痬、一甘油磷酸钠魑狟的诱导分化剂,可以促使其向成骨细胞定向诱导分化。我们的实验证实经细胞诱导剂作用后,基因表达明显增强。具有成骨细胞的特定表型,细胞胞浆内分泌有养两周则观察到细胞成片密集重叠生长,中央形成矿化结节。以脂质体将在实验中构建的一婧吮泶镌靥褰辛送肂奶逋庾内切酶、成功。是来源于中胚层问充质的定向干细胞,其具有多向分化潜能。由于从素干细胞上海第二医科大学博上学位论文
染。由于脂质体与谋壤粲诩际跄训悖虼耸紫冉辛俗H咎跫挠呕选,以绿色荧光蛋白魑1ǜ婊颉T谝粤魇较赴际跞范ǘ叩淖罴后,进行一婧吮泶镌靥宓耐肂逋庾H臼笛椤ǘ冉凶H鞠赴纳秆 J占H鞠赴屑觳狻D孀录一心康幕虮泶铮砻鱬籬狪在阳离子脂质体的作用下,成功进入兔骨髓间充质干细胞,并可转录出相应。狿允咀H竞蟮腂将用于修复的组织在体外进行预构,即将种子细胞与材料复合,形成组织替代物,因为包含了活体细胞、在机体局部内环境中增殖并分泌基质,从而可以加速修复过程。实验中比较了具有代表性的材料、凶H居氩牧系母春鲜笛椋匀范ㄏ赴氩牧系淖橹嗳菪浴采用体外复合培养法,将细胞与材料复合,电镜观察结果显示与雧两种材料相比,陶瓷与细胞具有良好生物相容性,细胞增生旺盛,密集,形态饱满。为进一步提高组织相容性,对材料以多聚赖氨酸、等进行了预处理,结果显示预处理后,牧舷赴匀惶缴ち己茫鳷组则经处理后细胞相容性明显改善,增殖旺盛,基质分泌活跃。翟诖砗髄、以在处有增强蛋白条带。显示转染细胞出现相应与目的基因相对分子量相符的印迹条带,表明本研究所构建的一一稍诎邢赴稳定转录、表达基因编码分子。流式细胞仪分析转染前后细胞增殖率期别为...,!:上海第二医科大学博上学位论文
天由对照组,±和上升为实验组±黾拥绞笛樽榈..=岷狭ρЪ跋嗳菪远嘞钪副辏选用魑O赴春霞昂笮迥谥踩胄薷吹娜斯す堑墓菇ú牧稀为验证体内血管形成的生物学作用,利用工程学的骨缺损模型进行体内修复实验,观察骨组织修复及血供重建作用。将构建人工骨回植新西兰兔缺损后,以未转染细胞组做对照,用⒌缇怠⒆橹Х椒ń屑觳狻片上观察照组早期血供丰富。骨痂形成早,骨结构发育较快。较早形成骨陷窝结构,同时到饨峡欤枨唤峁钩鱿衷缬诙哉詹唷1砻魇笛椴嘌9┘肮窍赴唤隙哉侧快,同时材料的降解也加速。而这两者又使骨有足够空间形成完整的骨结构包括小梁及髓腔、骨膜