文档介绍：北京协和医学院清华大学(医学部) 博士学位论文
Abbreviation(缩写)
TB4 Thymosin B4 胸腺素B4
IPTG Isopropyl-6--D--thiogalactoside 异丙基-
plementary DNA 互补DNA
PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应
' dithiothreitol 二硫苏糖醇
(;lB sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide
gel electrophoresis 聚丙烯酰***凝胶电泳 PVDF polyvinylidene difluoride 聚偏二乙烯二***酯 TRlS tris(hydroxymethyl)aminomethane 三羟***氨基甲烷 EDl’A etraacetic acid 乙二***四乙酸
CBD chitin binding domain 几丁质结合结构域
Ⅳ【TT 3■,5-dimethylibiazol一2-y1)一2,5-diphenyl
-tetrazolium bromide 噻唑蓝
MW molecular wight 分子量
TEM匣D Tetramethylethylenediamine N,N,N。,N’.四***乙二***
GsT G1utathion S—transferase 谷胱甘肽硫转移酶
TF5 thymosin fraction 5 胸腺素组分5
FBS fetal bovine serum 胎牛血清
HUⅦC Humam Unbilical Vein Endothelial cells 人脐静脉内皮细胞
CAPS 3-(Cyclohexylamino)-l-propanesuhinic acid ***基丙磺酸
X-gal 5-Bromo-4-chloro-3..indoxyl-B
-D-galactopyranoside 5-溴4***--B- Ammonium Persulfate 过硫酸铵
TNF tumor necrosis factor. 肿瘤坏死因子
CAJ Condon Usage Index 密码子使用指数
PBS Phosphate-buffered saline 磷酸缓冲溶液
RN筒 RNA inference RNA干扰
M∽tK mitogen—activated protein kinase 有丝分裂原活化蛋白激酶 M[MP matrix metal-proteinase 基质金属蛋白酶
ILK integrin-linked kinase 整合素偶联激酶
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北京协和医学院清华大学(医学部) 博士学位论文 2008_4
人胸腺素B4在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及生物
学活性鉴定
博士研究生:李宪奎
导 师:刘哲伟研究员指导老师:吴淑华研究员
摘要
胸腺素B4是胸腺素的有效组分之一,为1981年Low等人从小牛胸腺中提取分离纯化的,高度保守,由43个氨基酸组成,N端丝氨酸被乙酰化,,具有免疫调节的功能,是一种在多种组织均有表达的蛋白多肽,在体液, 血液中均存在。大量的研究表明胸腺素B4能够诱导内皮细胞分化,促进血管生
成,并能促进创伤的愈合和心肌梗塞时心肌细胞的存活和血管生成。胸腺素B4 在治疗皮肤、角膜创伤,治疗心肌梗塞,抗肿瘤治疗,抗炎等方面有着广阔的应用前景,目前胸腺素B4在治疗创伤、心肌梗塞等方面已经进入临床试验。由于天然状态下胸腺素13 4含量稀少,从组织中纯化它的成本较高;化学合成方法可以获得,但是价格昂贵。因此,本文利用基因工程技术对胸腺素13 4在大肠杆菌
.中的表达进行了研究,以期为进一步研究其生物学功能奠定基础。
(一)人胸腺素B4在原核系统中的克隆、表达及纯化首先按照大肠杆菌密码子嗜性对人胸腺素13 4的基因序列进行改造,用化学
法合***胸腺素13 4全基因序列,PCR方法扩增人胸腺素B4基因并在其两端引入Nde I和Xho I限制性酶切位点。将PCR扩增产物克隆至pGEM?T载体,转化DH5a,抽提质粒,测序鉴定,把序列正确质粒上的胸腺素B4基因亚克隆至原核表达载体pTXBl,转化大肠杆菌ER2566,在IPTG诱导表达,表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的50%,经过超声裂解,亲和层析,柱上裂解释放目的蛋
北京协和医学院清华大学(医学部) 博士学位论文 200&4
白,超滤,脱盐等处理得到重组人胸腺素B4纯品。纯化的胸腺素84经 —PAGE电泳分析只有一条带,纯度在90%以上。。
(二)人胸腺素13 4蛋白理化