文档介绍：实验五
动物肝脏中DNA的制备和鉴定
学时:6
1、掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。
2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
3、学习核酸染色的方法。
一、实验目的:
二、实验原理:
要获得纯的DNA样品,必须考虑以下几点:
如何选材,如何破碎组织细胞?
如何除去蛋白质?(在真核细胞内,DNA与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此,分离DNA时必须使其与蛋白质解离,并除去蛋白质。)
设法除去RNA的污染;
防止DNA酶的降解作用;
(一)动物肝脏DNA制备原理
选材
要提取动物组织DNA,一般选择细胞膜较脆弱,容易破碎的动物脏器,如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。
研磨:将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中,加入少量石英砂研磨或匀浆,破碎细胞。这种方法温和,适合实验室使用。
组织捣碎器:较剧烈的破碎细胞的方法,为了防止发热和升温过高,通常是转10秒—20秒,停10秒—20秒,可反复多次。
压榨法:在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压,细胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法,但仪器费用较高。
细胞破碎方法—机械物理法:
反复冻融法:将待破碎的细胞冷至-15℃到-20℃,然后放于室温(或40℃)迅速融化,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
超声波处理法:借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温,防止过热。
冷热交替法:在90℃左右维持数分钟,立即放入冰浴中使之冷却,如此反复多次,绝大部分细胞可以被破碎。
细胞破碎方法—机械物理法
有机溶剂处理法:利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDS(十二烷基硫酸钠)等表面活性剂处理细胞,可将细胞膜溶解,从而使细胞破裂,此法也可以与研磨法联合使用。
溶胀法:细胞膜为天然的半透膜,在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中,由于存在渗透压差,溶剂分子大量进入细胞,将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
细胞破碎方法—化学方法
(三)除去RNA的方法
脱氧核糖核蛋白在浓NaCl(1-2mol/L)溶液中溶解度很大, NaCl溶液中溶解度很低, NaCl溶液中,利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。
(四)除去蛋白质的方法
用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液,使蛋白质变性,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。
用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。
纯的DNA样品的获得
为了防止DNA酶的降解,提取时可加入适量EDTA(乙二胺四乙酸)、柠檬酸,以降低DNA酶的活性。
加入RNA酶降解剩余的RNA,获得纯的DNA。
保存:将DNA于滤纸上干燥,溶于1mlTE中低温保存。