文档介绍：实验四、五:目的基因的PCR扩增、 PCR产物的琼脂糖凝胶检测与 聚丙烯酰***凝胶电泳检测
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一、实验目的
1. 教学目的:PCR反应、产物检测的基本原理与实验技术
:具有PCR扩增体系设计、参数设置基本能力,掌握扩增产物检测方法
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二、实验原理
(聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)原理:体外快速扩增特定基因或DNA序列
PCR动画
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***凝胶检测原理
聚丙烯酰***凝胶有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰***的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰***形成毫无价值的粘稠溶液,而经双丙烯酰***交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加,并形成DNA分子通过的小孔。这些小孔的孔径随“双丙烯酰***~丙烯酰***”比率的增加而变小,比率接近 1:20 时孔径达到最小值。聚丙烯酰***凝胶大多按“双丙烯酰***~丙烯酰***”为1:29 配制,试验表明它能分离大小相差只有1-2bp 的DNA
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三、仪器、材料和试剂
(一)仪器
PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳系统(琼脂糖水平电泳槽和电泳仪)、紫外透射仪或凝胶成像分析系统、移液器(2,10,20,200,1000μl)、磁力搅拌器、垂直板电泳槽、水平摇床、枪头等耗材。
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(二)试剂、材料
:10×PCR缓冲液(含Mg2+) 、 dNTP混合物、 Taq酶、质粒DNA模板、引物对(正向引物和反向引物) 、PCR 管、丙烯酰***、过硫酸***、N,N,N’,N’-四***二乙***(TEMED)、Tris碱、硼酸、Na2EDTA·2H2O、冰醋酸、无水乙醇、Na2OH、AgNO3、甲醛、10 m mol/L dNTP混合物、 5U/uL Taq DNA聚合酶、10× PCR Buffer、50xTAE、引物对(鲤微卫星引物对)、过硫酸铵。
:1ng/ uL DNA模板
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:引物对筛选。(说明,该引物对为教师科研过程中筛选引物对,参考文献:岳兴建, 邹远超,. 生态学报. 2013, 33(13).)
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5×TBE 、10%过硫酸铵(AP) 、30%丙烯酰***母液
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四、实验步骤 (一)PCR
6个样本/同学,建议编制8个样本量以便分样
取样后要标记
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,振荡混合
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