丁香假单胞菌丁香致病变种检疫鉴定方法.doc

文档介绍：
点击此处添加中国标准文献分类号
SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
XX/T XXXXX—XXXX
丁香假单胞菌丁香致病变种检疫鉴定方法
Methods for quarantine and identification of Pseudomonas syringae
点击此处添加与国际标准一致性程度的标识
本稿完成日期:2013年6月20日
XXXX - XX - XX发布
XXXX - XX - XX实施
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局发布
前言
本标准依据国标GB/—2009起草编制。
请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位:中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。
本标准主要起草人:龚强、莫瑾、肖家勇、朱金国、孟芳、谭建锡、钟文英、彭梓、王晓丽。
丁香假单胞菌丁香致病变种检疫鉴定方法
范围
本标准规定了禾本科植物、植物材料及种子中假单胞菌的分离纯化方法以及丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae ) 的检测鉴定方法。
本标准适用于禾本科植物、植物材料及种子中丁香假单胞菌丁香致病变种的微生物学检测。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1809 进出境植物种子检疫规程
SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样
SN/T 2589 植物病原真菌检测规范
基本信息
拉丁文名:Pseudomonas syringae
分类地位: 细菌域、普罗特斯门、γ普罗特斯纲、假单胞菌目、假单胞菌科、丁香假单菌属
传播途径:病菌在种子和病组织中越冬。从伤口侵入寄主,也可从水孔、气孔侵入。细菌在水中可存活20-30天,随水流传播。暴雨、台风可加重病害发生。偏施氮肥,灌水过多或灌串水,易发病。偏酸性土壤发病重。
丁香假单胞菌丁香致病变种的其它信息见附录A。
原理
通过对禾本科植物、植物材料及种子进行分离培养、采用PCR特异性扩增方法对丁香假单胞菌丁香致病变种进行快速筛查鉴定后,通过生化方法进行检疫鉴定。
仪器和耗材
冷冻高速离心机:转速≤15 000 r/min;
PCR扩增仪;
恒温培养箱:30 ℃±1 ℃;
高压灭菌器;
均质器:转速4 000 r/min~8 000r/min
紫外分析仪。
培养基和试剂
金氏B培养基:;
PSA培养基:;
% 吐温20-磷酸盐缓冲液:;
革兰氏染色试剂:
***盐培养基:;
精氨酸双水解反应试剂:;
淀粉水解试剂:;
糖、醇或糖苷类分解:。
抽样
按照SN/T 1809及SN/T 2122规定进行取样。
样品处理及分离培养
样品处理
禾本科植物、植物材料样品剪成小碎片,随机称量待检禾本科植物、植物材料及种子20 g,流动水冲洗种子30 min~60 min。加入90 mL PBS(含,%Tween 20) 5℃~15 ℃浸泡3 h。
分离培养
选择10-1、10 -2、10 -3 三个浓度对浸泡液进行稀释,各取1mL 分别加入含金氏B培养基的培养皿,每个浓度做3个平行,涂布均匀,30±1 ℃培养48±2 h。
鉴定
初筛
P. syringae (2 mm~3 mm)、呈乳白色、光滑、边缘整齐。紫外检测器下检测金氏B培养基上的菌落,对产荧光菌落进一步鉴定。
挑取金氏B上4-6个产荧光素菌落接种PSA培养基,30±1℃培养48±2 h。革兰氏染色观察、氧化酶试验初筛。
分子生物学快速筛查
提取PSA纯化培养细菌基因组DNA(;),PCR扩增()、琼脂糖凝胶电泳分析(见附录D)。用丁香假单胞菌丁香致病变种标准菌株基因组DNA作为阳性对照,其它植物病原菌基因组DNA为阴性对照,双蒸水作空白对照,进行PCR扩增,扩增产物进行琼脂糖电泳分析。
病原的生化鉴定
挑取PSA培养基上菌落进行进一步的生化鉴定。按表1进行常规生化鉴定(附录B)和Biolog微生物鉴定系统鉴定。
表1 P. syringae pv. Syringae等四种假单胞菌生化鉴定表
生化反应 P. syringae pv. Syri