文档介绍：红豆杉里紫杉醇的提取分离及分析
实验材料与仪器
实验材料
新鲜红豆杉枝叶(树枝、树叶和树皮)。
实验试剂
主要试剂:
试剂名称 厂家
乙酸乙酯(分析纯) 北京化工厂
丙酮(分析纯) 北京化工厂
甲醇(分析纯) 北京化工厂
石油醚(分析纯) 北京化工厂
三氯甲烷(分析纯) 北京化工厂
二氯甲烷(分析纯) 北京化工厂
乙酸铵缓冲液(分析纯) 北京化工厂
乙腈(分析纯) 北京化工厂
去离子水(自制) 北京化工厂
紫杉醇标准品(纯度≧97%) 中国生物药监所
实验仪器
主要仪器:
仪器名称 厂家
XZ-6A 旋转蒸发器北京科龙仪器公司
CFSJ-8A粉碎机江苏瑰宝
JA 3003A电子天平上海精天电子仪器有限公司
岛津LC-6A高效液相色谱仪
CQ-500超声波振荡器
常压层析系统 Pharmacia公司
实验试液制备
标准品溶液制备
准确称取紫杉醇(Taxol)标准品(纯度≧97%),加入甲醇定容摇匀,。用HPLC检测。
样品试液制备
采集新鲜红豆杉枝叶,清水洗净,于60℃烘箱内干燥至恒重,用粉碎机粉碎,过14目筛。
,加入50mL乙酸乙酯-丙酮混合液(体积比1:1,下同),超声萃取30min,取上清液。
沉淀再加50mL乙酸乙酯-丙酮混合液超声萃取30min,取上清液,合并两次上清液,将提取液离心15min,转速4000r/min。
离心后取上清液加入5%活性炭粉,充分搅拌,待色素吸附完后进行真空抽滤,滤液用旋转蒸发器在40℃下蒸发至剩余少量液体。
加入石油醚(体积比1:1)充分振荡30min,静置5min,脱脂。萃取余液用三氯甲烷(体积比2:1)充分振荡30min,萃取滤液在30℃下减压浓缩蒸干,然后用15mL甲醇溶解,,得浸膏滤液,HPLC外标法测定紫杉醇含量,均分5等份,作好标识,备用。
实验方法
分离方法
液-液萃取
取浸膏滤液,加入二氯甲烷(浸膏/二氯甲烷的重量比为1:50),充分溶解,再加入与二氯甲烷等量的水。充分混合后静置分层,取有机相,弃水相。有机相再加纯化水萃取,重复三次。讲洗涤后的有机相减压浓缩蒸出二氯甲烷,所得固相浓缩物溶解于甲醇中,用HPLC作定量分析紫杉醇含量。
固相萃取
固相萃取过程包括四个步骤,即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的洗脱。流速稳定在5-8mL/min。
固定相活化:取乙酸乙酯10mL加入柱中,抽空。(pH=)的乙酸铵缓冲液10mL(乙酸铵水溶液),将页面维持在胶层上1-2mm。
上样及淋洗:讲样品溶于80%-90%的甲醇乙酸铵溶液中,,抽空。、50%的甲醇乙酸铵溶液淋洗,抽空。
紫杉醇的洗脱:在淋洗好的柱子中加入80%的甲醇乙酸铵溶液10 mL,收集洗脱液,减压蒸干。从洗脱液蒸干所得的固体物中取样,溶解于甲醇,作HPLC定性定量分析。
硅胶柱层析
硅胶用三氯甲烷浸泡,超声波脱气