文档介绍：实验四、质粒DNA的转化
一实验目的
二实验原理
三材料仪器
四实验步骤
五实验结果图
六结果讨论
七思考题
一、实验目的
学****将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。
转化(transformation):把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时,转化最易发生。
当受体菌处于感受态时,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收外源DNA。在培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中,载体中抗抗生素基因得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子(transformant)。
二、实验原理
三、材料仪器
实验仪器
超净工作台、恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、涂布棒,微量取样器,冰盒等。
实验材料
大肠杆菌DH5α感受态细胞;
质粒DNA:pCR4ToPoGt5GT7(Kan+Amp抗性);
LB固体培养基;
含Kan+Amp的LB固体培养基:将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp和Kan储存液,使终浓度分别为50µg/ml,摇匀后铺板。
,放置冰上;
µl感受态细胞悬液;
第一管为转化实验组:1µl重组质粒DNA+20µl感受态细胞;
第二管为阴性对照组;加入1µl无菌水+20µl感受态细胞悬液;轻轻摇匀,冰上放置30分钟;
℃恒温水浴中90秒,迅速将eppendorf管移到冰浴上,冷却2 min;
四、实验步骤
+
420C热击
370C复苏
Kan+Amp筛选
感受态
细胞
质粒
DNA
LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养20min,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗性基因;
涂布于含Kan+Amp的筛选平板上,涂布之后,在37℃培养箱中正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养12-16小时;
6. 涂布细则如下表:
组别
培养皿编号
DNA/μl
灭菌水/μl
平板抗性
受体菌/μl
1
1-1-对照-无
—
1
无
100
1-1-对照-Amp+Kan
—
1
Amp+Kan
100
1-1-转化-Amp+Kan
1
—
Amp+Kan
100
2
1-2-对照-无
—
1
无
100
1-2-对照-Amp+Kan
—
1
Amp+Kan
100
1-2-转化-Amp+Kan
1
—
Amp+Kan
100
3
1-3-对照-无
—
1
无
100
1-3-对照-Amp+Kan
—
1
Amp+Kan
100
1-3-转化-Amp+Kan
1
—
Amp+Kan
100
4
1-4-对照-无
—
1
无
100
1-4-对照-Amp+Kan
—
1
Amp+Kan
100
1-4-转化-Amp+Kan
1
—
Amp+Kan
100
5
1-5-对照-无
—
1
无
100
1-5-对照-Amp+Kan
—
1
Amp+Kan
100
1-5-转化-Amp+Kan
1
—
Amp+Kan
100
组别
培养皿编号
DNA/μl
灭菌水/μl
平板抗性
受体菌/μl
6
1-6-对照-无
—
1
无
100
1-6-对照-Amp+Kan
—
1
Amp+Kan
100
1-6-转化-Amp+Kan
1
—
Amp+Kan
100
7
1-7-对照-无
—
1
无
100
1-7-对照-Amp+Kan
—
1
Amp+Kan
100
1-7-转化-Amp+Kan
1
—
Amp+Kan
100
8
1-8-对照-无
—
1
无
100
1-8-对照-Amp+Kan
—
1
Amp+Kan
100
1-8-转化-Amp+Kan
1
—
Amp+Kan
100
9
1-9-对照-无
—
1
无
100
1-9-对照-Amp+Kan
—
1
Amp+Kan
100
1-9-转化-Amp+Kan
1
—
Amp+Kan
100