文档介绍：实验二总氮量的测定―凯氏定氮法
一目的:
学****凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理
掌握蒸馏、滴定操作技术
二、原理
生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义,蛋白质的含氮量约为16%,测出含氮量则可推知蛋白含量。
消化:有机物与浓硫酸供热,使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应,添加硫酸铜和硫酸钾的混合物;前者为催化剂,后者可提高硫酸沸点。甘氨酸的消化过程可表示如下: CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2十4H2O十NH3 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4
蒸馏:浓碱可使消化液中的硫酸铵分解,游离出氨,借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中,硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低,
(NH4)2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO4
2NH3+4H3BO3 (NH4)2B4O7+5H2O
滴定:用标准无机酸滴定,直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止,最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。
(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O (NH4)2SO4+4H3BO3
~ mg的氮量测定。
三、试剂
1、浓硫酸
2、粉末硫酸钾―硫酸铜混合物 3:1配比研磨混合
3、30%氢氧化钠溶液
4、2%硼酸溶液
5、标准盐酸溶液( mol/L)
6、混合指示剂(田氏指示剂) %%***红乙醇溶液混合配成,贮于棕色瓶中备用。
酸性时为紫红色,碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。
7、样品—面粉1g
五、操作方法
固体样品: 某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(%)。
一般样品烘干的温度都采用105℃,因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称一定量磨细的样品( g左右的干燥面粉),然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内,待降至室温后称重,按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后,称重一次,直到两次称量数值不变,即达恒重。
若样品为液体(如血清等),可取一定体积样品直接消化测定。
2、消化
取凯氏烧瓶标号。各加几颗玻璃珠;
,催化剂(K2S04+)200 mg,浓硫酸5 mL。
在3及4号瓶中各加相同量的催化剂和浓硫酸,作为对照,用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放―漏斗,在通风橱内的电炉上消化。
注意加样品时应直接送人瓶底,而不要沾在瓶口和瓶颈上。
消化开始时应控制火力,不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完,硫酸开始分解并放出SO2白烟后,适当加强火力,继续消化,直至消化液呈透明淡绿色为止。
定容:冷却后,加蒸馏水约10 mL。(注意慢加,随加随摇)。然后将瓶中溶物倾入50或100 mL的容量瓶中,并以蒸馏水洗烧瓶数次,将洗液并入容量瓶,用水稀释到刻度,混匀备用。
蒸馏: 改进型凯氏定氮仪结构
特点:将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体,体积小,安装容易,操作简便。
(1)水蒸汽发生器和反应室
(2)冷凝器和通气室
(3)排水柱
关键:搞清水管系统
蒸馏器的洗涤
1. 接通冷凝水,先向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜) 。
:
将蒸馏水由加样室加入反应室,加样口水封,用酒精灯将其加热烧开
将酒精灯移开片刻,反应室内水自动喷出到蒸汽发生器
打开蒸汽发生器出水口,放水。
如此反复清洗3-5次。
mL,2%硼酸溶液和1~2滴指示剂的混合液。打开冷凝水,进行蒸馏,如3-5min不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。
3 蒸馏过程:
准备:
取50 mL锥形瓶3个,各加入5 mL 2%硼酸溶液和1―2滴指示剂,溶液呈淡紫色,用表面皿覆盖备用。
打开冷凝水,置换成冷水。将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下,并使冷凝器下端浸没在液体内。
加样:
用移液管取5 mL消化液(空白液和消化液分别做),细心地加入反应室,随后用小量筒加入30%NaOH溶液5mL,关闭自由夹,在加样漏斗中加少量水做封口。
蒸馏:
关闭自由夹,打开冷凝水(注意不要过快过猛,以免水溢出,实验过程中,冷凝水可一直打开)。
点燃酒精灯,蒸馏开始,当观察到锥形瓶中的溶液由淡紫色变绿时(约2―3分钟),开始计时,蒸馏3分钟,移开锥形瓶,使冷凝器下端离开液面约1cm,同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧,继续蒸馏1分钟,取下锥形瓶,用表面皿覆盖瓶口。
蒸馏完毕后,应立即清洗反应室,方法如前所