文档介绍：常见的实验注意事项
贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办? 可用 N NaOH / % SDS 洗结块
Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎么办? N HCl冲洗
Nandrop: 帐号李大伟老师(li d w) 密码: 62732710
自己的超声波: 用大10头, 功率 600W;用小3头, 功率不大于 200W
如果pcr不成功,可能是pfu出了问题,也许是pfu没有活力(太多,太少或者buffer不对)
做酶切回收的质粒一定要用kit提
质粒连不上可能是胶回收问题,最好加异丙醇,终浓度可达50%
做SDS-PAGE的30%丙烯酰胺一定要过滤
蛋白质离心浓缩一定要用水平转子
蛋白质纯化一定用milli Q的水,最好每步都加1mM DTT
所有的FPLC柱子和填料一定要用20%乙醇保存
mono Q 结合蛋白质洗脱不下来, 可能都被mono Q吸附上杂质或长菌,可能是柱子上滤膜出了问题
Mono Q洗柱子的方法: (实在不行重新灌柱) isopropanol 10 vol; 1MNaCl 10 vol; HCl, 饱和EDTA, % triton, 一些CTAB, 10 vol;1M NaCl 10 vol; M NaCl 10 vol 每周都要洗一次
Superpose 6洗柱子的方法: (实在不行重新灌柱) isopropanol 10 vol; 1MNaCl 10 vol; HCl, 饱和EDTA, % triton, 一些CTAB, 10 vol;1M NaCl 10 vol; M NaCl 10 vol
pH 8 调到用1M溶液调pH值 1:4, 一般是1:10
pet 15b 加上Met MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM 共21个氨基酸
pet 32b 除去 trx MHHHHHHSSGLGGENLYFQGS 共21个氨基酸
300ml 10N NaOH 非精制胰蛋白胨/L
370ml 10N NaOH 精制胰蛋白胨
Trx: pI
Tev : pI
u可溶于碱的污染物
mol/L NaOH洗涤 Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤结合缓冲液洗涤
可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。
u对于疏水性污染物
乙醇溶液(如70%的乙醇)或非离子型的去污剂洗涤
可以除去脂类和其他的疏水性物质。
u金属污染物
EDTA饱和的10 mmol/L HCl(即pH=2)处理柱子
u沉淀物杂质
去污剂、尿素和盐酸胍,可将柱子在6 mol/L 的尿素中平衡和温育,然后用去离子水和缓冲液洗涤
Centrifuge samples to avoid the risk of non-specific binding of the target molecule to a
filter. Samples such as serum can be filtered through glass wool to remove remaining lipids.
Non-specific cause: proteins binding to medium and/or to the plastic tubes or the presence
of protein aggregates that co-precipitate with the plex
It is reported that CHAPS stabilizes GR and prevents non-specific adsorption of GR to tubes and mono-beads [6 and 7. . Fletcher, . Warren, . Baumann and . Hager. Methods Mol. Biol. 176 (2001), p. 55. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (1)7].
载体: ul
NEB buffer 2 1ul
BSA
T4 dna pol
100mm dttp
100mm Dtt ul
反应体系于22℃ 30min后,75℃ 20min将酶灭活。
(另:一个文献上没有说明的优点,NEB T4 DNA POL在普通的限制性内切酶Buffer中的活性为100%,也就是说,载体酶切后不用乙醇沉淀,就可