文档介绍：酵母RNA的提取
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1、实验目的
1、掌握稀碱法提取RNA的原理和方法
2、学习和了解其它提取RNA的方法和原理
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2、实验重点和难点
离心机的使用
提取RNA的实验原理
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3、实验原理
一般的生物细胞中同时含有DNA和RNA,在酵母中RNA比DNA的含量高得多, RNA(~%),DNA则少于2%(%~%),在实验室常用酵母作为RNA提取的材料。若要制备具有生物活性的RNA,可采用苯酚法、去污剂法和盐酸胍法等,最常用的是苯酚法提取RNA;若对生物活性没有要求,则可使用浓盐法,稀碱法等。工业中用稀碱法或浓盐法,主要用于制备核苷酸的原料.
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苯酚法:组织匀浆用苯酚处理并离心后,RNA即溶于上层被酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留在酚层中,向水层加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出,此法能较好地除去DNA和蛋白质。
浓盐法:在加热的条件下,利用高浓度的盐改变细胞膜的透性,使RNA 释放出来,再利用等电点(~)沉淀。此法易掌握,产品颜色较好。盐浓度需要控制,太低,RNA不易从细胞中释放出来,太高,细胞急剧收缩不利于抽提。一般80~120g/L为宜。
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稀碱法:利用细胞壁在稀碱条件下溶解,使RNA释放出来,这种方法提取时间短,但RNA 在稀碱条件下不稳定,容易被碱分解;
本实验采用的稀碱,既可加速细胞的破裂,又可增大 RNA的溶解度。当碱被中和后,可用乙醇(或者异丙醇)将RNA沉淀,或用等电点沉淀RNA(应严格控制pH,缓慢调),此为 RNA的粗品。
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核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以测出上述组分的存在。
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核酸
核苷酸
磷酸
核苷
戊糖
碱基
水
解
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(1)嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。
(2)磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀[(NH4)3PO4·12MoO3↓],有还原剂存在时,形成蓝色钼蓝。
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(NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4
H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O
H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 • MoO3(钼蓝)
还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值,当无机磷含量在1—25μg 范围内,光吸收和含磷量成正比。
%,即1μg μg RNA。%。
Vit • C
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