实验二基因克隆一ppt课件.ppt

文档介绍：实验二基因克隆(一)
基因组DNA的提取和限制性内切酶酶切分析
实验目的
掌握基因组DNA制备的原理和方法
了解DNA限制性内切酶作用特点和酶切消化的操作步骤
实验原理
1. 基因组DNA的提取和纯化
真核生物染色体DNA组装不同层次的结构
核酸分离、纯化原则
保持核酸分子一级结构的完整性;
排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染;
无杂核酸分子的污染(如纯化DNA分子时应去除RNA分子);
基因组DNA制备的基本思路
匀浆组织,破碎细胞
去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子
沉淀核酸
去除盐类、有机溶剂等杂质
纯化干燥
溶解
蛋白酶K和SDS破碎细胞
在匀浆后提取DNA的反应体系中,SDS可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分子分离,EDTA抑制细胞中DNase活性,蛋白酶K将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。
酚/***仿抽提去除与DNA结合的蛋白质
酚是很强的蛋白质变性剂,***仿能加速有机相与水相分离,溶解去除残留的酚,且可以去除蔗糖等,在***仿中加入少量异戊醇可减少蛋白质变性过程中产生的大量气泡。
乙醇和醋酸钾沉淀核酸
核酸为水溶性,在有机溶剂和高盐存在下,核酸在水中的稳定性被破坏,呈不溶状态而沉淀下来。
基因工程
pUC18的酶切图谱