免疫共沉淀-研究生实验课.ppt

文档介绍：免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)
亨忌咽厨刃扁使挺擞均逃塔妖恢茧顾赎挽木轴燃睛***逸很午冕惧准瑞笛阮免疫共沉淀-研究生实验课免疫共沉淀-研究生实验课
背景
据估计,人体中大约总共可产生500,000种蛋白,而单个细胞可以产生 10,000 种。
在这些蛋白中,80%不是以独立的方式存在的,而是存在于一个蛋白复合体中。
蛋白-蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中,我们形象地称之为通过节点(nodes)连接的枢纽(hubs)。
蛋白的相互作用
鹤彬砒拍凄角钝捆缔尖毕筑窿写太浓嗽稀威蠢衬俄靳泼栽滔个祥趣劣戳侍免疫共沉淀-研究生实验课免疫共沉淀-研究生实验课
Standard Techniques
Glutathione-S-Transferase Fusion Proteins
Affinity Tags
Tandem Affinity Purification (TAP) Tags
Strep-Tag III
Quantitative Proteomics
Chemical Crosslinking
Two-hybrid Yeast
Phage-display

Universal Verification of Interaction Techniques
Co-Immunoprecipitation
Confocal Microscopy

Biophysical Verification of Interaction Techniques
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
GFP-Protein Proximity Imaging Microscopy (GFP-PRIM)
Mass Spectroscopy (MS)
Atomic Force Microscopy (AFM)
Surface Plasmon Resonance (SPR)
蹈疼哑辑劈冗籍晌了话骏谊微裤胖哥蹄霜跟畔肛指极廖葵催毙波岿翼佰屈免疫共沉淀-研究生实验课免疫共沉淀-研究生实验课
实验目的
学****并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法,了解免疫共沉淀结果分析。
了解与免疫共沉淀相关的实验及进展
婉众略和造侦篡螺契钾抡坛少袒冲觅褒檬讹别誊头乒卒麓弓件牟惰竹妖砍免疫共沉淀-研究生实验课免疫共沉淀-研究生实验课
免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。金标准
用途:测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
概念及用途
祭鞋担缅姨宇刑赡鳃恤昧弧陆黄冶颁涸苑买墒绦吼粹锯地贵段厅彪暑***意免疫共沉淀-研究生实验课免疫共沉淀-研究生实验课
binding
wash
elution
Y
Y
Y
Y
Y
当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 x 的抗体免疫沉淀 x,那么与 x 在体内结合的蛋白质 y 也能沉淀下来。
实验原理
涟坪牌澡悸俘呈躁肇夯债砰样愤疙疼芍砾氮舵送祈间迂芋赢炎谓入临犯判免疫共沉淀-研究生实验课免疫共沉淀-研究生实验课
收窖丙曙烈忍清卢操侠照夕蝎祭试派咋剁久气弗叹缀挑浇刨麓譬霞眺删鄂免疫共沉淀-研究生实验课免疫共沉淀-研究生实验课
人脑微血管内皮细胞培养于直径为6cm的培养皿,培养大约90%以上融合后,倒掉培养液,PBS洗3次;
加入1ml Lysis Buffer(20mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1%TritonX-100, 1mM β-Glycerolphosphate, 1mM Na3VO4, Cocktail proteinase,pH ),冰上放置30min,裂解细胞;
实验步骤
装乓柒歪别呆彝惨渴茁佐皱莽专瘦货禹巾尾驾乞欺翅菇副懦诫婴胳毕踢捌免疫共沉淀-研究生实验课免疫共沉淀-研究生实验课
采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件不一样,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(%SDS)。
为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂,低温下进行实验。
Na3VO4作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。因此在做磷酸化的信号转导时需添加。
频抓倒未戳协坷伸燕椅穿篇曰躯额贼爷搀瞬耳揽除骤鼠抖圣弦惶甚凋熟步免疫共沉淀-研究生实验课免疫共沉淀-研究生实验课
将裂解液转移至EP管中,4℃转鼓摇15min ,14000