文档介绍：核酸提取及常见问题分析
主讲人:刘召华
唐维(修改)
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第一部分:DNA提取方法简介
第二部分:DNA提取常见问题、
原因分析及其对策
内容
第三部分:RNA提取方法简介
第四部分:RNA提取及其RT-PCR常见
问题、原因分析及其对策
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核酸是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。
前言
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第一部分:DNA提取方法简介
第二部分:DNA提取常见问题、
原因分析及其对策
第三部分:RNA提取方法简介
第四部分:RNA提取及其RT-PCR常见
问题、原因分析及其对策
第一部分:DNA提取方法简介
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DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
CTAB法
SDS法
其它
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DNA提取的几种方法
非基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
碱裂解法
煮沸法
线粒体、叶绿体DNA的提取
差速离心结合SDS裂解法
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基因组DNA- CTAB法
CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三***溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。
具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,在这种条件下,蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里
该复合物在高盐溶液中(> NaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注:CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。
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CTAB提取缓冲液的经典配方
组份
Tris-HCl ()
EDTA ()
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
终浓度
100 mM
20 mM
2%(W/V)
%(V/V)使用前加入
Tris-HCl ()提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;
NaCl 提供一个高盐环境,使DNP(脱氧核糖核蛋白)。CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;
β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除
基因组DNA- CTAB法
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褐变
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CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl ()
EDTA ()
NaCl
CTAB
PVP40
β-巯基乙醇
终浓度
100 mM
20 mM
3%(W/V)
5%(W/V)
2%(V/V)使用前加入
PVP(聚乙烯吡咯烷***)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。
基因组DNA- CTAB法
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