文档介绍：M 2000
CAT. NO. 11668-027 Size:
CAT. NO. 11668-019 Size: ml
4℃储存(不要冻存)
说明:
LipofectaminTM 2000是核酸(DNA或RNA)转染真核细胞的一个专用的试剂盒,其有如下优点:
对各种细胞及细胞板(如96孔板)都有高的转染效率,在系数据库中有各种细胞转染成功的实例。
在含有或是不含有血清的培养基中,DNA- LipofectaminTM 2000复合物能够直接加给细胞。
在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液,但在培养4-6小时后需要除去复合物。
关于转染的一些重要建议:
不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。在i上有转染步骤,登陆后点击说明。
对于大多数细胞系,转染复合物中DNA(μg)M 2000(μl)的比例在1:2到1:3之间,最好达到最优化的比例。注意:在混合之前,我们建议用Opti-MEM I 低血清培养基(Cat: -062)(reduced serum medium)M 2000和DNA.
为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应,受体细胞最好达到高的浓度:在转染时,细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化混浊度。此外,在实验过程中保证相同的接种条件。
为避免细胞死亡,在培养基中不要加抗生素。
由于一些无血清复合物(如CD239、SFM II、VP-SFM)会抑制阳离子脂质体介导的转染,M 2000的相容性。
转染步骤(用于DNA):
按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。
贴壁细胞:转染的前一天,-2×105个细胞,以保证在转染时候细胞的混浊度达到90%-95%。
悬浮细胞:在准备转染混合物时,每500μl无抗生素培养基中含有细胞数量为4-8×105。
对于每个转染样品,按下面的方法准备:
在50μl无血清Opti-MEM I 低血清培养基中(或是其它无血清培养基)稀释DNA,并轻轻混匀。
M 2000,然后取相应的量稀释在Opti-MEM 培养基中。室温下静置5分钟。注意:M 2000和DNA的稀释液。
室温下静置5分钟后,M 2000和DNA的稀释液(总体积为100μl)。轻轻混匀并在室温下静置20分钟(溶液混合后可能会看上去浑浊)。注意:混合物在室温下
的6个小时内不会失效。
细胞板的每个孔中加混合液100μl,并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀。
检测目的基因的表达情况前,细胞于37℃ CO2培养箱中培养18-48小时。此时不需要改变培养基,但4-6小时后也许需要更换.
对于固定的细胞系:转染24小时后将细胞以1:10(或更高的稀释度)稀释度转移到新鲜的生长培养基中。如果需要的话,在以后的培养中可以在培养基中加入选择培养基。
对于悬浮的细胞系:转染4小时后,如果需要,加入PMA和/或PHA以提高CVM启动子的活性并促进基因表达。
转染量度标准:
在不同的组织培养板中转染细胞时,根据相对的表面积,M 2000、细胞、和培养基,具体情况剪下表。在自动、高产率体系中,建