文档介绍：-027Size:-019Size:℃储存(不要冻存)说明:LipofectaminTM2000是核酸(DNA或RNA)转染真核细胞的一个专用的试剂盒,其有如下优点:对各种细胞及细胞板(如96孔板)都有高的转染效率,在数据库中有各种细胞转染成功的实例。在含有或是不含有血清的培养基中,DNA-Lipofectamin2000复合物能够直接加给细胞。在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液,但在培养4-6小时后需要除去复合物。关于转染的一些重要建议:不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。在i上有转染步骤,登陆后点击说明。对于大多数细胞系,转染复合物中DNA(μg)与Lipofectamine2000(μl)的比例在1:2到1:3之间,最好达到最优化的比例。注意:在混合之前,我们建议用Opti-MEMI低血清培养基(Cat:-062)(reducedserummedium)、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应,受体细胞最好达到高的浓度:在转染时,细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化混浊度。此外,在实验过程中保证相同的接种条件。为避免细胞死亡,在培养基中不要加抗生素。由于一些无血清复合物(如CD239、SFMII、VP-SFM)会抑制阳离子脂质体介导的转染,因此有必要检测一下无血清培养基和Lipofectamine2000的相容性。转染步骤(用于DNA):按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。:转染的前一天,-2×10个细胞,以保证在转染时候细胞的混浊度达到90%-95%。悬浮细胞:在准备转染混合物时,每500μl无抗生素培养基中含有细胞数量为4-8×105。,按下面的方法准备:在50μl无血清Opti-MEMI低血清培养基中(或是其它无血清培养基)稀释DNA,并轻轻混匀。使用前轻轻混匀Lipofectamine2000,然后取相应的量稀释在Opti-MEM培养基中。室温下静置5分钟。注意:要在30分钟内混合Lipofectamine2000和DNA的稀释液。室温下静置5分钟后,混合Lipofectamine2000和DNA的稀释液(总体积为2TMTM3.100μl)。轻轻混匀并在室温下静置20分钟(溶液混合后可能会看上去浑浊)。注意:混合物在室温下的6个小时内不会失效。细胞板的每个孔中加混合液100μl,并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀。4.检测目的基因的表达情况前,细胞于37℃CO2培养箱中培养18-48小时。此时不需要5.改变培养基,但4-:转染24小时后将细胞以1:10(或更高的稀释度)稀释度转移到新鲜的生长培养基中。如果需要的话,在以后的培养中可以在培养基中加入选择培养基。对于悬浮的细胞系:转染4小时后,如果需要,加入PMA和/或PHA以提高CVM启动子的活性并促进基因表