文档介绍：第十三章基因工程和分子生物学常用技术
ic Engineering and The Popular Technology In Molecular Biology
第1节基因工程与基因重组
ic Engineering and bination
一、基因工程的概念
基因工程是将各种来源(内、外)的原核、真核、天然或人工方法获得目的基因,在体外与载体基因重组后,导入适当的宿主细胞,DNA重组体随着细胞增殖而扩增,再通过基因表达得到大量目的基因片段(分子克隆,clone)的技术。
基因工程技术是把不同来源的目的基因和载体DNA分子重新组合,故亦称为重组DNA技术。
基因工程四要素

重要的工具酶
(1)限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)
发现:
1968年,沃纳·阿尔伯博士在研究噬菌体的遗传现象时碰到一个奇怪的现象,当新的大肠菌感染了噬菌体时,有的噬菌体开始繁殖,有的却根本不繁殖。他决定先研究这种“限制性噬菌体感染现象”,第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶,为此获1978年诺贝尔生理学医学奖。限制酶能在DNA上寻找特定的切点,将DNA分子的双链交错地切断。因此限制性内切酶又称为“分子剪刀”,可以完整地切下个别基因。目前人们已经分离提取了 400多种“分子剪刀”,可以随心所欲地进行DNA分子长链的切割。
沃纳·阿尔伯博士
、特点
识别DNA的特异序列并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸水解酶。是基因工程“分子刀”。
特点:*切割DNA多聚核苷酸链中磷酸二酯键
*具有回文结构特征
5′•••GAATTC•••3′
3′•••CTTAAG•••5′

限制性核酸内切酶
识别序列及切割位点
切割产物
形成末端
EcoRⅠ
3’黏性末端
PstⅠ
5’黏性末端
NruⅠ
平末端
5’…G↓AATTC…3’ 5’…G AATTC…3’
3’…CTTAA↑G…5’ 3’…CTTAA G…5’
5’…CTGCA↓G…3’ 5’…CTGGA G…3’
3’…G↑ACGTC…5’ 3’…G ACGTC…5’
5’…A G↓CT…3’ 5’…AG CT…3’
3’…TC↑G A…5’ 3’…TC GA…5’
注:具有黏性末端的DNA分子更容易结合进载体DNA分子中。
(2)DNA聚合酶(DNA polymerase)
以DNA为模板,dNTP为原料,RNA作引物,从引物的3’-末端或切口3’-末端沿5’→3’方向延长核苷酸链。该酶具有3’→5’或 5’→3’核酸外切酶活性。
DNA聚合酶Ⅰ、T4 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶等。
(3)DNA连接酶(DNA ligase)
1976年,科学家在5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶,这种酶可以将两个DNA片段连接来,修复好DNA链的断裂口。这种酶叫作DNA连接酶,是名符其实的“缝合”基因的“分子针线”。只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种 DNA碎片中加上“分子针线”,就会把两种DNA片段重新连接起来。
慢病毒环绕双链DNA的DNA连接酶(彩色部分)
载体
能够携带外源DNA片段进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具。其化学本质是DNA。
易进入宿主细胞,并能在体内繁殖。
具有多克隆位点,易插入外源基因。
有可供选择的遗传标记,能够进行筛选。
易从宿主细胞中分离纯化。
常用载体:质粒、噬菌体、黏粒、病毒。
理想载体的选择标准