文档介绍：植物激素的酶联免疫吸附测定法( ELISA)
免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的,根据可视化方法的不同可分为:
酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测
定法等。由于酶联免疫吸附分析法 (Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称 ELISA)
具有灵敏性、特异性高,且方便、快速、安全、成本低廉的特点,而日益被广泛应用于
植物激素测定。目前,几大类植物激素 IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、 ZR、DHZR等都建立
了相应的 ELISA 方法并有试剂盒出售。
植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式(见下图) ,一种是在固相载体上 直接包被
抗体 (直接法,先包被二抗,再加一抗) ,另一种是 包被抗原 (间接法)。
直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。间接法利用游离抗原和吸附
抗原与游离抗体进行竞争。间接法的原理可用下式表示:
Ab+H+HP=AbH+AbHP
其中 Ab 表示抗体, H 表示游离激素, HP表示吸附在板上的激素-蛋白质复合物。根
据质量作用定律,当该反应体系中 Ab 及 HP的量确定时,游离 H 越多,结合物 AbH形成
的就越多,而 AbHP形成的就越少,即结合在板上的抗体就越少,通过酶标二抗检测结
合物 AbHP的多少,就可以确定游离 H 量的多少。
材料、试剂及设备
1 材料
各种新鲜植物材料
2 仪器设备
研钵,冷冻离心机,台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置,酶联免疫分光光度
计,吸水纸,恒温箱,冰箱,酶标板( 40 孔或 96 孔),可调微量液体加样器( 10μ l ,
40μl,200 μl,1000 μ l ),带盖瓷盘(内铺湿纱布) 。
3 试剂
3, 3
(1) 包被缓冲液:称取1 .5g Na2CO3,  NaHCO  NaN(可不加) , 用量
筒加 1 000 ml 蒸馏水, pH为 
2 4 2 4
(2) 磷酸盐缓冲液( PBS):称取  NaCl,  KHPO ,  NaHPO・12HO,
用量筒加 1 000 ml 蒸馏水, pH为  。
6 8 7 2 2 4
(3) 样品稀释液: 100 ml PBS 中加  ml Tween-20 , 明胶(稍加热溶解) 。
(4) 底物缓冲液:称取  C HO・ H O(柠檬酸),  NaHPO・12HO,溶解
定容至 1 000ml ,再加 1 ml Tween-20 ,pH为  。
4
(5) 洗涤液: 1000ml PBS 加 1mlTween-20。
(6) 终止液: 2mol/L H 2SO。
( 7)提取液: 80%甲醇,内含 1 mmol/L BHT( 二叔丁基对甲苯酚,为抗氧化剂,先
用甲醇溶解 BHT,在配成 80%的浓度 )) 。
( 8)激素包被抗原、各激素抗体和标准物。
( 9)酶标二抗:辣根过氧化物酶( HRP)标记的羊抗兔抗体。
操作步骤

( 1) 称取 - 新鲜植物材料( 若取样后材料不能马上测定,用液氮速冻后保存