文档介绍：实验五考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
一、实验目的
掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法
熟练分光光度计的使用和操作方法。
实验原理
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种,它与蛋白质的疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色,最大光吸收峰在465nm,当它与蛋白质结合形成复合物时,其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色,在一定范围内,595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系,故可以用于蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法,本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
离心机的使用说明: ,重量不等时将水加在管套里。 ,要求必须对称。 3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后,再定时间,定好时间后缓慢旋转转速旋钮,使离心机均匀的提速到预定转速。
分光光度计的使用说明: ,预热20min后,再选择须用的单色光波长。 ,盖上样品室盖,推动试样架拉手,使对照比色皿(溶液装入4/5高度,置第一格)置于光路上,调节100%透射比按钮,使吸光度值A=。 ,使样品比色皿置于光路上,读出吸光度值。 ,取出比色皿,洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。 “关”,拔下电源插头。
试剂与器材:
试剂:
(1)%NaCl:9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。
标准蛋白质:称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。
染液:考马斯亮蓝G-250 ,溶于250mL95%乙醇,再加入500mL85%(W/V)
磷酸,保存于棕色瓶中,称为母液。取150 mL然后加蒸馏水定容到1000mL,保存于棕色瓶中,备用。
器材:
试管;吸管10mL、l5mL、lmL、;722分光光度计
操作方法
标准曲线的制备
取6支试管,按下表加入各试剂:
管号
0
1
2
3
4