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文
二0 年月
扩增基因鉴定生物检材种属焓±控兰要摘┛牙级楸す缋俭嗡咳硕士生骆宏导师陆惠玲教授中山大学中山医学院法医物证学教研室背景种属鉴定在法医学实践和打击走私动物的工作中具有重要的地位。以往主要用血清学、细胞学或生化方法进行鉴定。但相当一部分现场检材的特殊性和复杂性,常可能失去传统方法鉴定种属的条件。随着分子生物学技术的不断发展,先后出现了多种新的种属鉴定方法。扩增靶基因鉴定物种来源,使检测结果更为客观,且易于判读。但既往的研究较少涉及特殊检材、尤其是人和动物混合检材的种属鉴定。因此,有必要对这些领域进行研究。近年来在种属鉴定方面研究较多的是细胞色素基因的研究表明,该基因进化速率与蜃榈钠骄俾驶鞠嗤在核形奁淇奖础Mü基因序列的比对分析,发现该基因在同一物种内比较稳定,不同物种之间序列差异较大。充分利用这种序列的保守性和差异性,设计通用引物扩增通用片段进行测序,或者设计针对目标物种的特异性引物扩增目的片段,可以区分不同的物种。鉴于此,本研究着手探讨基因在种属鉴定的应用。基因,建立一种能够在同一反应条件下鉴定多个具体物种,同时又满足简单,快速,特异、灵敏、准确等实用要求的种属鉴定方法。媒⒌姆椒ǘ蕴厥獯砑觳暮突旌霞觳慕兄质艏ㄑ芯俊方法从中搜索出人、鸡、鸭、鹅、猪、兔、鼠、绵羊、水牛、狗、山羊等个物种的基因全长序列,用砑榷院螅杓一对针对上述个物种的通用引物和分别针对人、鸡和鸭等目标种属的特异引广东广州占%基因,基因%虳—%6目的┰
舵印畆山丸肇基因,根据扩增片段的大小差异鉴定种属。以通用引物扩增片段为参照,特异引物扩增片段用于种属鉴定,分别对陈旧血痕、新鲜/冰冻肌肉、高温处理肌肉、毛干等单一组份检材和二元混合生物检材进行鉴定;特异引物扩增目标种属和非目标种属基因以检测其特异性;目标种属扩增产物的测序结果与扔行蛄斜榷裕萜銲种档高低判断被检序列与既有物种序列的一致性程度,从而检测该法能准确性;对单一检材、混合检材稀释成不同浓度后扩增,检测本法的灵敏度;用盲测法检验本法的实用性。结果通用引物扩增个物种的基因,各物种不同类别检材均有笥业睦┰銎危渲腥、鸡⒀、猪⒍、绵羊⑴、鼠⑼、山羊⒐骸;针对人、鸡和鸭的特异引物只对各自目标种属有扩增产物,未见交叉扩增现象,各目标种属的特异片段大小为:入⒓、鸭荒勘曛质舨庑蚪峁隚既有序列比对,分值:人ァ⒓ァ⒀%;灵敏度检测:目标物种的通用引物扩增,灵敏度为匾煲锢┰⒀均为欢曰旌霞觳难芯勘砻鳎榉軩在混合械暮恐灰8哂诩觳灵敏度即可被准确检出,且不受其他组份干扰;盲测结果与实际检材完全相符。结论本研究通过设计通用引物和特异引物,扩增不同物种、不同类别检材基因,实现了同一从μ跫┰龆喔瞿勘晡镏值哪康幕颍而可同时鉴定多个物种的种属。在国内首次对人和动物的混合检材进行了种属鉴定研究。所建立的方法操作简单、灵敏度好、结果准确、有高度的特异性和较强的实用性,为法医学实践和打击走私动物提供了一种崭新的方法。关键词:法医物证学种属鉴定基因生物检材物,同时扩增各物种的中山医学嚏硕士学位论文
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第言引种属鉴定的方法痕、碎尸块、骨骼、肌肉、交通事故逃逸车辆上附着的生物检材和私运的动物组顺利侦破提供进一步的线索。随着犯罪分子作案手段的日趋狡猾,除了上述现场检材外,不乏有高温烹煮和油炸处理碎尸组织作食品的特殊检材出现⋯,如何对学方法主要有沉淀反应、抗人血红蛋白胶体金试验、凝集反应和酶联免疫吸附试在法医学实践和打击走私动物的活动中,常常需要对各种刑事案件的现场血织等作种属鉴定,以明确检材来自人体还是某种动物,为后续个体识别和案件的这些特殊检材进行种属鉴定及个体识别,给法医工作者提出了新的挑战。以下就种属鉴定的方法、技术、选用的基因及各自的特点作一叙述。.撤椒传统的种属鉴定方法主要有:血清学方法、细胞学方法、生化方法⋯。血清验等。细胞学方法主要通过观察红细胞大小、形态、有无细胞核等来判断血痕的物种来源。生化方法主要有纤维蛋白板法、碱变性试验、等电聚焦法等。这些方法中,血清学方法和生化方法主要针对蛋白质水平的检测,对检材的质量要求较高,如要求检材量较多、较新鲜、难以用于高温处理、腐败降解检材等;细胞学方法中,血液干燥后,红细胞皱缩或破坏,则比较难观察其真正大小和形态。实际工作中收集的检材种类繁多,有的检材己腐败降解,或受到细菌、异物等污染、酶解;有的检材数量较少等,这些检