文档介绍：实验一••米氏常数的测定
生化分析实验一
实验日期: 年月日
双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数
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【实验冃的】以过氧化物酶为例,掌握测定酶促反应初速率和米氏常
数的原理及方法
【实验原理】1913年,Michaelis和Menten运用酶反应过程中形成中
间络合物的原理,首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式,即著名
的米氏方程:
v?Vmax??S?式中:v为反成初速率(微摩尔浓度变化/min); Vmax为最大反应速率(微摩Km?S尔浓度变化/min); ?S?为底物浓度(mol/L); Km
为米氏常数(mol/L)。这个方程式表明当已知Km及Vmax时,酶反应速率
与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速率达到最大反应速率
一半时所对应的底物浓度,是酶的特征常数之一。不同酶的Km值不同,
同一种酶与不同底物反应Km值也不同,Km值可以近似的反应酶与底物的
亲和力大小:Km越大表明亲和力越小;Km越小表明亲和力越大。大多数纯酶的
?100 mmol/L。通过米氏方程的不同变形,可有多种求
算米氏常数的方法,一般较常用的双倒数法,即取米氏方程的倒数式:
lKmllllll????以对作图得一直线,该直线与横轴截距?。
vVmaxSVmaxSKmvS过氧化物酶是一种对氢受体(H2O2)底物有特异性,
对氢供体底物缺乏特异性的酶,它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元
胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应,可用于微量过氧化氢含量测定,
也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质:如葡萄
糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆留醇等,亦是免疫分子和核酸分析中常用
的标记物。通常使用的过氧化物酶是从植物辣根中提取的,因此也称为辣
根过氧化物酶(horseradish
peroxidase, HRP)。HRP属于含血红素蛋白的一种,是由辅基 氯化
血红素(铁卟啉)和脱辅基蛋白(糖蛋白)组成,分子量为44000。
HRP是双底物酶(过氧化氢+多元酚或胺类底物),为求其对某一底物
的Km,通常的做法是令另一底物的浓度相对于待测底物大大过量,即可
把该酶促反应当作单底物反应来处理。本实验我们选用3,3’,5,5’-四甲基
联苯胺(TMB)作为氢受体,它可被Hb催化过氧化氢氧化生成宥色产物, 该产物在反应条件下(pH5-7左右)为蓝色物质(?max=650 nm)o实验中我们使TMB的浓度人过量,测定HRP对H2O2的Km值(反之亦可测定
HRP 对 TMB 的 Km 值)。
【实验仪器及试剂】
仪器:日立UV-3010紫外可见分光光度计;石英比色皿(lcm): 2
只;100 ?L微量取样器1支(枪头若干);ImL取液器一支;电