文档介绍：郑州轻工业学院
硕士学位论文
酪氨酸酶天然源抑制剂的研究报告
姓名:杨定乾
申请学位级别:硕士
专业:@
指导教师:马庆一
2007
摘要

本论文包括五个部分:
第一部分:酪氨酸酶抑制剂研究综述
从酪氨酸酶抑制剂的结构、性质、作用机理、构效关系和资源等方面概述了
目前酪氨酸酶抑制剂的研究现状,探讨今后该领域的研究重点和发展方向。
第二部分:酪氨酸酶的提取与初步纯化及其性质的研究
因为进口酪氨酸酶和常用底物多巴价格昂贵,且多巴又易为空气氧化,为了
建立一个经济、方便、有效的体外酪氨酸酶抑制剂筛选模型,采用缓冲液提取、
硫酸铵盐溶盐析、透析及反渗透等方法从双孢菇中提取并部分纯化了酪氨酸酶,
并以 L-酪氨酸为底物,开创性地选择在波长 317nm,而不是传统上的 475nm 处比
色,以测定酶活。结果表明:丙酮沉淀,硫酸铵盐溶盐析的纯化方法可使酪氨酸
酶的比活力提高倍; 于波长 317nm 处比色测酪氨酸酶活性,在 0-10min
内呈良好线性关系,灵敏度远较传统法高,而重复性问题,只要细心选择适当的
反应速度,亦可满意地解决。动力学研究测得该酶的 Km = , Vmax
= 。最适 pH 为 ,在 pH 5-7 之间,酶的活力最高;最适反应温度
为 30℃,在 20-40℃范围内保持较高的活性。
第三部分:菠萝中酪氨酸酶抑制因子的提取、分离与初步纯化
菠萝汁中组分复杂,活性成分含量甚微,特别是其中大多为水溶性成分,相
关分离与纯化手段较少。实验中将菠萝切片并真空干燥(得率 %),干物质
甲醇提取(得率 %),再将提取物浓缩至干后经石油醚、二氯甲烷、乙醚、
乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇梯度提取得率依次为、、、、
和 %。酶反应动力学试验跟踪显示菠萝中抑制酪氨酸酶的活性成分存在
于乙醇组分,定性试验结果表明,活性成分的分子具有糖苷的结构特征,而无酚
羟基存在。当浓度为 g/mL 时,抑制率 %; 经过柱层析纯化后当浓度
为 g/mL 时抑制率升至 %,且为不可逆抑制机制。
第四部分:菠萝源抑制剂对双孢菇汁抗褐变实验
I
将酶动力学筛选得到的天然酪氨酸酶抑制成分应用于双孢菇浆的抗褐变,
以考察本课题中所建立的酪氨酸酶动力学体外筛选模型在实际应用中的有效
性。结果表明:菠萝汁、乙醇粗提物、柱层析纯化后的组分 H4,在浓度分别为
、和 ﹪时对双孢菇浆的褐变均有一定程度的抑制作用,其抑制率
分别为、和 ﹪,按抵制率大小依次为:H4﹥乙醇粗提物﹥菠萝汁。
说明菠萝汁中的确含有可以抑制某些食品褐变的功能成分,也进一步证实这一
体外筛选模型是可行的。
第五部分:菠萝中酪氨酸酶抑制因子的纯化及其性质的研究
菠萝中的活性成分经过硅胶柱层析后的色谱纯组分 H4 再经 sephedexLH20 凝
胶层析后,液相分析显示纯度为 %。酶反应体系中浓度 4μg/mL 时,酶活
被安全抑制。核磁、电喷离电离质谱分析结果显示活性成分可能是分子量为 442
的糖苷,其糖部分为果二糖,苷元为甲氧基呋喃。

关键词:褐变酪氨酸酶抑制剂菠萝

II
ABSTRACT

This thesis consists of five parts:

The first part: study of tyrosinase inhibitors

The current research on tyrosinase inhibitors was reviewed from five aspects ,structure,
character, working mechanism, resource and the relations between structure and
activity to discuss the focus and the trend of development in this field and to broaden
the ideas to find out some new hypoglycemic functional factors.

The second part: extraction